栾晶胡峰瑞郭慧芳劳可静苟兴春*

(1.陕西省缺血性心血管疾病重点实验室,陕西省脑疾病重点实验室,西安医学院基础与转化医学研究所,西安 710021;2.陕西省感染与免疫疾病重点实验室(西安医学院),西安医学院基础医学部,西安 710021)

1907年,Alois Alzheimer描述了一种疾病,其特征是严重的认知障碍、定向障碍、失语、妄想以及不可预测的行为表现,该病病程呈持续性进展,患者平均在4.5年后死亡,在病理检查中存在脑萎缩和神经原纤维缠结的特征性改变[1]。1910年,Kraepelin以他的名字命名了这种疾病,即阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)[1]。目前,AD已经成为老年群体中继心脏病、恶性肿瘤、脑卒中后第4位死亡原因[2]。据2014年报道的一项基于我国人群的横断面调查统计,65岁以上人群AD发病率为5.14%,到2050年,全球AD患者将达到1.315亿[3]。

AD是一种衰老相关疾病,因发生在老年期和老年早期,在国内又被称为老年性痴呆。衰老的特征是机体生理功能和稳定组织内环境的能力持续性下降,这将导致退行性疾病的发病率及死亡率的增加[4]。流行的衰老理论认为,免疫功能的下降是导致机体衰老的重要因素[5]。随着年龄的增长,机体的免疫功能逐渐减弱,免疫系统无法产生保护性免疫,免疫系统的保真度和效率降低,称为免疫衰老[6]。骨髓中的造血干细胞(hematopoietic stem cell,HSC)分化为整个免疫系统的免疫细胞。已有研究报道,免疫系统的老化根源于HSC的老化[7-8],造血系统的老化表现为适应性免疫系统和先天免疫系统功能的下降。人体先天性免疫系统和适应性免疫系统会随着年龄增长发生变化,前者更加活跃,后者功能下降[9]。而AD患者的先天性免疫系统和适应性免疫系统与同龄健康人比较是否发生结构和比例的变化,相应干细胞结构和比例是否发生变化,目前研究较少,没有明确结果。

前期研究发现,造血干细胞(即C-kit+Sca-1+细胞)遍布C57BL/6小鼠的外周血、脾、淋巴结等免疫器官,并且各免疫器官中不同免疫细胞的比例以及其中造血干细胞的比例随着小鼠月龄的增加出现规律性的变化,13月龄以上的小鼠体内T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞、巨噬细胞以及自然杀伤细胞(natural killer cell,NK)中C-kit+Sca-1+比例出现显著性上升或下降,表明在该时间点干细胞的平衡和稳定性被破坏,可能是C57BL/6小鼠免疫和机体衰老的重要时间点[10]。基于上述线索,推测AD作为衰老相关疾病,其小鼠免疫系统比例和结构以及相应的造血干细胞比例可能不同于同月龄正常小鼠。本研究收集了9月龄的AD小鼠及同窝对照C57BL/6小鼠。检测天然免疫和适应性免疫系统的免疫细胞,包括NK细胞、单核细胞、巨噬细胞、CD4+T淋巴细胞、CD8+T淋巴细胞、B淋巴细胞。同时检测相应的具有造血干细胞特性(C-kit+Sca-1+)的细胞比例的变化。由于AD发病机制尚不能明确,一旦发病无法治愈,现有医疗手段只能延缓病情进展,暂无有效治疗方法。明确AD小鼠先天性免疫系统和适应性免疫系统的比例和结构的变化,以及相应的造血干细胞的分布和变化,可为AD发病机制的解析以及AD患者免疫系统的老化提供了更多的研究基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

9月龄SPF级AβPPswe/PS1ΔE9(C57BL/6背景)阿尔茨海默症小鼠(AD小鼠)及其同窝对照小鼠,每组各6只,雄性,(26 ± 3)g,购自北京维通利华公司【SCXK(京)2016-0011】,小鼠在西安医学院基础与转化医学研究所SPF级动物房的独立通风笼(IVC)中饲养,温度20 ~ 26℃,相对湿度40% ~ 70%,最小静压差 ≤ 10 Pa,动物光照15 ~ 20 lx,实验场地的使用许可证号【SYXK(陕)2022-04】。饲养方法严格按照GB14925-2010 执行,实验动物操作按照《实验动物使用及实验规程国家标准》执行。所有操作均符合西安医学院伦理审查委员会要求(批准号XYLS2019019)。

1.1.2 主要试剂与仪器

大鼠抗小鼠流式抗体CD3-PE-Cy7、CD4-FITC、CD8-PerCP-Cyanine5.5、B220-APC、F4/80-APC、CD11c-PE-Cy7、MHC Class II(I-A/I-E)-FITC、CD115-PerCP-Cyanine5.5、Ly-6A/E-PE-CF594、CD117-PE均购买于美国BD公司。FACS Calibur流式细胞仪,购自美国贝克曼库尔特有限公司。

1.2 方法

1.2.1 小鼠Y迷宫检测

Y迷宫由长×宽×高为30 cm × 8 cm × 15 cm的3个长方体拼接而成的,角度互为120°,背景为白色。基于小鼠喜欢探索新环境的特性,人为在迷宫的3个臂内部贴有种不同颜色和不同形状标的记物,以利于小鼠进行空间定位,检测间人员位置与物品摆放位置不变。将小鼠面壁放入起始区,每次每只小鼠按A、B、C 3个臂的顺序进入,计时8 min,记录小鼠探索轨迹。小鼠在Y迷宫中,倾向于交替探索3个不同臂(分为A、B、C3个臂),例如ABC,ACB,BAC,BCA,CAB,CBA 等作为实际转换次数(alternation),BCB、ACA、BAB等不计入,探索进臂总次数减2作为最大转换数。并计算转换率=[正确交替反应次数/(N-2)]×100%,此值越高说明记忆力越好。

1.2.2 流式检测

小鼠安乐死后摘取脾,200目筛网中研磨成单个脾淋巴细胞,无血清1640或者PBS重悬后置于冰上备用。将上述小鼠的脾细胞悬液在离心机中离心5 min,条件为4℃ 2000 rpm,离心后弃上清;加PBS重悬后调整细胞浓度至每毫升1 × 107个,取200 μL于新的流式管中进行各淋巴细胞染色。

1.3 统计学分析

数据采用GraphPad Prism 8软件(加利福尼亚州,美国)进行分析。各组数据在分析前进行Shapiro-Wilk正态性检验,正态分布数据以平均值 ± 标准差(±s)表示。两组数据比较均采用独立样本t检验,以P＜ 0.05 为差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 小鼠Y迷宫结果

首先明确了9月龄AβPPswe/PS1ΔE9阿尔茨海默症小鼠与其同窝对照正常小鼠的行为学表现差异。Y迷宫实验结果显示,如图1,AD小鼠在Y迷宫自发性交替实验转换率的表现较其同型对照正常小鼠相比显著降低(P= 0.0118)。以上结果证实了AD小鼠模型的可靠性,9月龄AD小鼠已经有明显的行为学表型。

注:与WT组相比,*P ＜ 0.05。(下图同)图1 WT、AD小鼠在Y迷宫自发性交替实验转换率的表现Note.Compared with group WT, *P ＜ 0.05.(The same in the following figures)Figure 1 Spontaneous alternation rates of WT and AD mice in the Y maze spontaneous alternating experiment

2.2 小鼠脾淋巴细胞流式分析

在验证AD小鼠模型的可靠性后,将两组小鼠于标准SPF环境中(温度20 ~ 26℃,相对湿度40% ~ 70%),自由饮食饮水条件下继续饲养1周。1周后用1%戊巴比妥钠麻醉小鼠,摘取小鼠脾,200目筛网中研磨成单个脾淋巴细胞,用无血清1640或者PBS重悬后将细胞浓度调整至每毫升1×107个,取200 μL于新的流式管中进行各淋巴细胞染色。脾各免疫细胞配色方案及流式分析步骤如图2所示。

2.2.1 小鼠脾各淋巴细胞比例

按照以上的配色方案以及流式分析步骤,检测了9月龄AD小鼠以及其同窝对照野生型小鼠脾中CD4+T、CD8+T、B细胞、单核细胞、巨噬细胞以及树突细胞的比例,结果发现,以上各免疫细胞的比例在野生型小鼠及AD小鼠中无明显差异,如图3所示。

图3 小鼠脾CD4+ T、CD8+ T、B细胞、单核细胞、巨噬细胞以及DC细胞比例 Figure 3 Proportion of CD4+T, CD8+T, B cells, monocytes, macrophages and DC cells in the spleen of mice

注:A:CD4+T、CD8+T、B淋巴细胞分选步骤;B:单核细胞、巨噬细胞、树突细胞分选步骤;C:C-kit+ Sca-1+细胞分选步骤。图2 脾各免疫细胞配色方案及具体流式分析步骤Note.A.Sorting steps of CD4+T, CD8+T and B lymphocytes.B.Sorting steps of monocytes, macrophages and dendritic cells.C.Sorting steps of C-kit+ Sca-1+cells.Figure 2 Color scheme of immune cells in spleen and the procedure of flow cytometry

2.2.2 小鼠脾淋巴细胞中C-kit+Sca-1+细胞比例

检测了9月龄AD小鼠以及其同窝对照野生型小鼠脾中CD4+T、CD8+T、B细胞、单核细胞、巨噬细胞以及树突细胞中具有HSC特性的细胞比例(即C-kit+Sca-1+细胞比例)。结果发现(见图4):在AD小鼠脾适应性免疫系统CD4+T、CD8+T、B细胞中,C-kit+Sca-1+细胞比例均高于其同窝对照正常小鼠,但由于小鼠个体差异较大,结果没有统计学意义。AD小鼠脾天然免疫系统单核细胞、巨噬细胞以及DC细胞中,C-kit+Sca-1+细胞比例均低于其同窝对照正常小鼠,结果在巨噬细胞和树突细胞中具有显著性差异(P＜ 0.05)。

图4 小鼠脾CD4+ T、CD8+ T、B细胞、单核细胞、巨噬细胞以及DC细胞中C-kit+ Sca-1+细胞比例Figure 4 Proportion of C-Kit+ SCA-1+ cells in CD4+ T, CD8+ T, B cells, monocytes, macrophages and DC cells in the spleen of mice

3 讨论

由于AD病理学的主要特征是淀粉样斑块和神经原纤维缠结。在过去的几十年里,淀粉样蛋白级联假说是AD研究领域的主流学说[11]。然而,最近的研究结果对这一假说提出了挑战,越来越多的研究为免疫衰老在AD发病中的重要作用提供了支持证据,认为免疫衰老积极参与AD的发病机制并介导炎症损伤[12],AD是最常见的与年龄相关的一种神经退行性疾病,AD的发病可能是由免疫系统以年龄依赖性方式进行调控[13],免疫和炎症反应的改变可能在AD的进展中起主要作用的观点越来越得到认可。

随着年龄的增长,机体的免疫功能逐渐减弱,免疫系统无法产生保护性免疫,免疫系统的保真度和效率降低,称为免疫衰老。免疫衰老的一个主要特征是炎症和抗炎网络之间的失衡,伴随着持续的低水平炎症和对自身免疫反应的更大易感性[14]。免疫系统的免疫细胞是由骨髓中的HSC分化而来,免疫系统的老化根源在于HSC的老化[15]。研究发现与年轻C57BL/6小鼠HSC相比[16-18],衰老的HSC的竞争性再增殖能力下降了2 ~ 4倍,年轻小鼠的干细胞在单细胞水平上产生更成熟的外周血细胞,它们更能平衡地产生髓系细胞和淋巴系细胞。大多数HSC在稳态下处于静止状态,自我更新潜力有限[19]。造血过程受到内在和外在机制的严格调控,这些机制平衡了静止、自我更新和分化以维持正常体生理需要的多谱系重建[20-21]。随着每一次细胞分裂,HSC分化为血细胞的潜能下降,同时,潜能降低的子代造血祖细胞数量增加,以弥补单个干细胞功能的丧失[22]。因此,造血干细胞自身的大量增殖,会导致造血干细胞的耗竭;而静息状态有利于维持造血干细胞的功能和干性。

AD患者的先天性免疫系统和适应性免疫系统与同龄健康人比较是否发生结构和比例的变化,相应干细胞结构和比例是否发生变化,目前研究较少,没有明确结果。本研究通过检测9月龄AD小鼠以及其同窝对照野生型小鼠脾中CD4+T、CD8+T、B细胞、单核细胞、巨噬细胞和树突细胞的比例,以及上述免疫细胞中具有HSC特性的细胞比例(即C-kit+Sca-1+细胞比例),发现虽然AD小鼠脾各免疫细胞的比例与其同窝对照正常小鼠相比无明显差异,但更深入的分析发现:AD小鼠脾中各免疫细胞比例中具有HSC特性的细胞比例存在差异,在AD小鼠脾适应性免疫系统CD4+T、CD8+T、B细胞中,C-kit+Sca-1+细胞比例均高于其同窝对照正常小鼠。AD小鼠脾天然免疫系统单核细胞、巨噬细胞以及DC细胞中,C-kit+Sca-1+细胞比例均低于其同窝对照正常小鼠。说明AD小鼠免疫系统存在加速衰老的现象,这有可能是潜在的AD发病机制。

值得一提的是,同时检测了AD小鼠的外周血、胸腺和淋巴结,但由于AD小鼠本身的发病可能与免疫系统有关,加之AD小鼠造模本身需要的时间较长(8个月以上),与正常小鼠相比,AD小鼠的淋巴结和胸腺的大小等在不同的小鼠个体之间差异较大,研磨后收集到的免疫细胞数较少,包括在外周血中,C-kit+Sca-1+细胞本身比例较小,C-kit+

Sca-1+细胞数达不到统计学要求,导致流式结果稳定性差。后续更大样本量的验证以及更深入的AD免疫细胞变化随年龄增长的动态研究有利于更深入的机制的解析。综上,本研究主要发现在AD小鼠和正常小鼠脾中C-kit+Sca-1+细胞比例有明显差异这一明显现象存在,基于本文研究结果,相关机制的深入展开研究更有意义也更有趣。