蒋金金张国富董雅琪丁世彬*

(1.江苏医药职业学院,江苏 盐城 224005;2.新乡医学院,河南 新乡 453003)

空气污染是一个严重威胁人群生命和健康的公共卫生问题,其中空气动力学直径小于或等于2.5微米的大气细颗粒物(particulate matter 2.5,PM2.5)对人体健康的危害引起越来越多的关注。目前,PM2.5是我国空气污染物主要组成之一。悬浮在空气中的PM2.5随着人体呼吸进入呼吸道的细支气管和肺泡腔表面并沉积[1],因此肺被认为是PM2.5暴露的直接靶器官。流行病学数据表明,PM2.5浓度每增加10 mg/m3,呼吸系统死亡率增加2%[2];长期PM2.5暴露与呼吸系统疾病、肺癌和心血管疾病的死亡率增加显著相关[3]。急性PM2.5暴露能通过引起肺组织炎症并导致实验动物的肺损伤[4-5];且实验中选用的实验动物为健康动物和哮喘动物模型[5-6]。酒精暴露改变了吸入灰尘所致的肺组织炎症应答[7],但PM2.5暴露对AFLD模型动物肺组织的影响尚无报道。NLRP3(nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein)炎性小体是炎症反应的主要参与者,其不但参与颗粒物诱导的呼吸系统炎症[8-9],而且与肝疾病的发生、发展有密切关系[10],但NLRP3炎性小体在急性PM2.5致肺损伤中的作用尚未阐明。本研究主要观察急性PM2.5暴露对C57BL/6J小鼠和AFLD模型小鼠肺炎症和肺NLRP3炎性小体活性的影响,为急性PM2.5暴露所致肺损伤的防治提供潜在靶点。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物

40只8周龄SPF级雄性C57BL/6J小鼠,体重20 ~ 24 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司【SCXK(京)2016-0002】。室温为22~25℃,湿度60%~70%,实验期间小鼠自由摄食饲料和饮水,饲养在新乡医学院公共卫生学院实验动物房【SYXK(豫)2016-0006】,动物实验操作过程严格遵守新乡医学院实验动物伦理委员会伦理管理要求(实验动物伦理审批号:XXMU-2016-0007)。

1.1.2 主要试剂与仪器

白细胞介素(interleukin,IL)-6,IL-1β和肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor α,TNF-α)的商业化ELISA试剂盒(上海酶联生物科技有限公司,中国);引物合成(上海生工生物技术有限公司,中国);RNA提取试剂盒(北京鼎国生物科技有限公司,中国);反转录试剂盒和SYBR试剂盒(北京宝生物工程有限公司,中国);石英纤维滤膜(PALL,美国);血细胞检测仪(Rayto,美国);离心机(Eppendorf,德国);实时荧光定量PCR仪(罗氏,瑞士);全自动酶标仪(Thermo,美国)。

1.2 方法

1.2.1 PM2.5样品采集及处理

在新乡医学院科技楼7楼楼顶作为采样点,将石英纤维滤膜安装于大流量颗粒物采样器(Tisch Environmental,美国,TE-6070C),每日连续24 h采集大气PM2.5。PM2.5收集完成后取出石英纤维滤膜,并置于-20℃保存。将载有PM2.5的石英纤维滤膜剪碎,浸泡在超纯水中连续超声20 min,然后真空干燥后称量PM2.5重量,用无菌生理盐水将PM2.5配成7.15 mg/mL的悬液待用。

1.2.2 动物分组及PM2.5染毒

实验动物适应性喂养1周后,随机分为4组:对照组;PM2.5染毒组;酒精性脂肪肝模型(AFLD)组和AFLD+PM2.5染毒组(AFLD+PM2.5)。AFLD组和AFLD+PM2.5组小鼠连续8周给予Lieber-DeCarli 饲料(南通特洛菲饲料科技有限公司)以建立AFLD模型小鼠;对照组和PM2.5染毒组给予对照饲料(南通特洛菲饲料科技有限公司)。从第9周开始,PM2.5组和AFLD+PM2.5组小鼠通过气管滴注的方式给予PM2.5(10 mg/(kg·bw))染毒,小鼠每天染毒1次,连续染毒7次。对照组和AFLD组小鼠同时气管滴注生理盐水。

1.2.3 分离小鼠血液和肺组织及检测相关指标

最后1次染毒结束24 h后,用戊巴比妥(20 mg/kg)将小鼠麻醉后,心脏穿刺取血,然后脱臼处死小鼠,分离肺组织,左肺用低温预冷PBS液灌洗,收集肺泡灌洗液(BALF)。用血细胞检测仪检测血细胞计数水平。按ELISA检测试剂盒说明书测定IL-6,IL-1β和TNF-α在BALF的水平。

1.2.4 肺组织苏木素-伊红(HE)染色

分离肺组织后,迅速将右肺组织放入4%多聚甲醛溶液进行固定,肺组织切片HE染色,在显微镜下观察肺组织组织病理学和炎细胞浸润情况。

1.2.5 肺组织RNA提取及NLRP3炎性小体相关蛋白的mRNA水平检测

将1.2 mL TRIzol加入称量好的100 mg肺组织中,匀浆后按试剂盒说明书的步骤和方法提取肺组织总RNA。依据RNA逆转录试剂盒说明书将RNA逆转录成cDNA;然后依据试剂盒说明书采用标准荧光实时定量PCR技术方法,扩增目的基因并检测荧光信号。将β-actin作为内参基因。用2-△△CT法计算mRNA的相对表达水平。全部引物序列如下:NLRP3基 因 引 物 为F5’-TGGGTTCTGGTCAGA CACGAG-3’,R5’-GGCGGGTAATCTTCCAAATGC-3’;衔接分子凋亡相关斑点样蛋白(ASC)引物为F5’-GGAGTCGTATGGCTTGGAGC-3’, R5’-CGTCCACTTCTGTGACCCTG-3’;Caspase-1引物 为F5’-TGCCGTGGAGAGAAACAAGG-3’,R5’-CCCCTGACAGGATGTCTCCA-3’;β-actin引 物 为F5’-TTCGTTGCCGGTCCACACCC-3’, R5’-GCTTTGCACATGCCGGAGCC-3’。

1.3 统计学分析

研究结果用平均值 ± 标准差(±s)表示,并用SPSS 25.0统计软件包对数据统计分析。对于正态分布资料,用单因素方差分析(ANOVA)对多组均数进行比较,组间均数比较采用Dunnet’T3检验或LSD检验。对于非正态分布资料,采用非参数秩和检验对多组均数进行比较。检验水准为α = 0.05。

2 结果

2.1 建立AFLD小鼠模型

为建立AFLD小鼠模型,在研究中使用国内外通用的Lieber-DeCarli饲料喂养小鼠8周后,通过肝HE染色发现:AFLD模型组小鼠的肝细胞胞质中出现大量散在的脂肪空泡,呈脂肪变性病理改变,因此确认建模成功。

2.2 急性PM2.5染毒对C57BL/6J小鼠和AFLD小鼠血细胞的影响

由表1可见,PM2.5染毒组和PM2.5+AFLD组小鼠的血中白细胞和单核细胞百分比显著高于对照组,有统计学意义(P＜ 0.01);并且PM2.5+AFLD组小鼠血中白细胞和单核细胞百分比显著高于AFLD组,有统计学意义(P＜ 0.01)。但4组小鼠的血中性粒细胞百分比无明显差异(P＞ 0.05)。

表1 急性PM2.5染毒对C57BL/6J小鼠和AFLD小鼠血细胞的影响(±s,n = 8)Table 1 Effect of acute PM2.5 exposure on blood cells in C57BL/6J mice and AFLD mice(±s,n = 8)

表1 急性PM2.5染毒对C57BL/6J小鼠和AFLD小鼠血细胞的影响(±s,n = 8)Table 1 Effect of acute PM2.5 exposure on blood cells in C57BL/6J mice and AFLD mice(±s,n = 8)

注:与对照组相比,*P ＜ 0.01;与AFLD组相比,#P ＜ 0.01。Note.Compared with Control, *P ＜ 0.01.Compared with AFLD, #P ＜ 0.01.

分组Groups白细胞(×106/mL)WBC(×106/mL)单核细胞(%)MONO(%)中性粒细胞(%)NEUT(%)对照组 Control 6.00 ± 0.34 1.49 ± 0.25 21.65 ± 2.57 PM2.5染毒组 PM2.5 6.98 ± 0.29* 2.39 ± 0.38* 22.73 ± 2.47 AFLD组 AFLD 6.07 ± 0.40 1.68 ± 0.25 21.26 ± 2.92 AFLD+ PM2.5组 AFLD+ PM2.5 7.44 ± 0.59*# 2.81 ± 0.40*# 21.36 ± 2.02

2.3 PM2.5暴露对C57BL/6J小鼠和AFLD小鼠肺组织HE染色的比较

由图1的肺组织切片HE染色可见,对照组和AFLD组小鼠肺组织未见明显异常;与对照组和AFLD组相比,PM2.5染毒组和AFLD+PM2.5组小鼠肺泡间隔明显增宽,有明显的炎性细胞浸润;并且与PM2.5染毒相比,AFLD+PM2.5组小鼠肺泡间隔明显增宽;这些结果表明急性PM2.5暴露能导致小鼠肺组织炎症,并且AFLD小鼠肺组织对PM2.5的炎性应答强于C57BL/6J小鼠。

图1 PM2.5暴露对C57BL/6J小鼠和AFLD小鼠肺组织HE染色的比较Figure 1 Comparison of HE staining in the mouse lung tissues of C57BL/6J and AFLD

2.4 急性PM2.5暴露对C57BL/6J小鼠和AFLD小鼠BALF和血清中促炎细胞因子表达的影响

由图2可见,PM2.5染毒组小鼠BALF中IL-1β,IL-6和TNF-α表达明显高于对照组,具有统计学意义(P＜ 0.01);PM2.5+AFLD组小鼠BALF中IL-1β,IL-6和TNF-α表达明显高于AFLD组,有统计学意义(P＜ 0.01)。此外,与PM2.5染毒组相比,PM2.5+AFLD组小鼠BALF和血清中IL-1β和TNF-α表达显著增高(P＜ 0.05)。

2.5 急性PM2.5暴露对C57BL/6J小鼠和AFLD小鼠肺组织NLRP3炎性小体组成蛋白mRNA的影响

由图3可见,PM2.5染毒组小鼠肺组织中NLRP3,Caspase-1和ASC的mRNA表达均显著高于对照组,具有统计学意义(P＜ 0.01或P＜ 0.05);AFLD+PM2.5组小鼠肺组织中NLRP3和Caspase-1的mRNA表达均显著高于AFLD组,具有统计学意义(P＜ 0.01)。但AFLD+PM2.5组和PM2.5组小鼠的肺组织ASC的mRNA表达差异无统计学意义(P＞ 0.05)。

3 讨论

流行病学研究已经报道,大气PM2.5的增高与呼吸系统疾病(如急性上呼吸道感染、肺炎、哮喘和慢性阻塞性肺疾病)的就诊次数增加密切相关[11]。目前,炎症是PM2.5暴露导致机体毒性损伤的主要原因之一,但具体分子机制尚待阐明。许多动物实验研究发现,PM2.5暴露能导致实验动物的肺炎症和促炎细胞因子增加[12-13],但这些研究大多关注PM2.5暴露对健康实验动物肺损伤的影响。近20年来我国人群的酒精消费日益增多,随之而来的是AFLD的患病率显著上升[14]。据我们所知,国内外关于PM2.5暴露对饮酒人群及AFLD人群肺的毒性效应影响尚无报道。本实验主要比较研究急性PM2.5暴露对C57BL/6J小鼠和AFLD模型小鼠肺炎症和NLRP3炎性小体活性的影响,并分析急性PM2.5暴露导致肺损伤发生的可能机制。

注:与对照组比较,**P ＜ 0.01;与AFLD组相比,##P ＜ 0.01;与PM2.5染毒组相比,△P ＜ 0.05,△△P ＜ 0.01。图2 急性PM2.5暴露对小鼠BAFL和血清IL-1β,IL-6和TNF-α表达的影响Note.Compared with Control, **P ＜ 0.01.Compared with AFLD, ##P ＜ 0.01.Compared with PM2.5, △P ＜ 0.05, △△P ＜ 0.01.Figure 2 Effects of acute PM2.5 exposure on the expression of IL-1β, IL-6 and TNF-α in the mouse BAFL and serum

注:与对照组相比,*P ＜ 0.05,**P ＜ 0.01;与AFLD组相比,##P ＜ 0.01;与PM2.5染毒组相比,△△P ＜ 0.01。图3 急性PM2.5暴露对C57BL/6J小鼠和AFLD小鼠肺组织NLRP3炎性小体相关蛋白mRNA表达的影响Note.Compared with Control, *P ＜ 0.05, **P ＜ 0.01.Compared with AFLD, ##P ＜ 0.01.Compared with PM2.5, △△P ＜ 0.01.Figure 3 Effects of acute PM2.5 exposure on the mRNA expression of NLRP3 inflammasome-related proteins in the mouse lung tissues of C57BL/6J and AFLD

为应对我国大气污染的严峻形势,切实改善空气质量,自2013年开始我国政府发布了《大气污染防治行动计划》,并采取一系列强有力的治理措施控制空气污染,近年来空气质量得到极大改善。然而,受气象条件等多种自然因素影响,目前我国许多地区和城市的PM2.5浓度在短期内仍能持续超过世界卫生组织(WHO)公布的关于PM2.5水平的第1个过渡阶段标准(即24平均PM2.5浓度为75 μg/m3)。因此,本实验依据该标准并结合实验小鼠的生理参数将10 mg/(kg·bw)的PM2.5暴露浓度[15]作为开展本次急性PM2.5暴露研究的剂量。长期PM2.5暴露会导致Wistar大鼠肺组织出现不同程度结节,肺组织出现大范围炎性反应病变[16]。本研究通过对小鼠肺组织切片HE染色观察发现,急性PM2.5暴露能导致肺泡间隔增宽,并且PM2.5导致AFLD模型小鼠的肺泡间隔增宽程度大于PM2.5染毒的C57BL/6J小鼠。炎症应答是人类对吸入颗粒物的早期反应。之前的一项研究发现,急性PM2.5暴露能增加Balb/c小鼠肺泡灌洗液和肺组织IL-1β水平,并导致急性肺炎症发生[17]。实验结果显示:急性PM2.5暴露能显著增加BALF中促炎细胞因子IL-1β和炎性细胞因子IL-6和TNF-α水平,并且PM2.5染毒的AFLD模型小鼠BALF中促炎细胞因子IL-1β和炎性细胞因子NF-α水平显著高于PM2.5染毒的C57BL/6J小鼠;以上结果表明急性PM2.5暴露引起小鼠肺组织发生了广泛的炎症反应,AFLD模型小鼠可能对PM2.5引起的炎症反应更敏感。此外,观察到急性PM2.5暴露能改变白细胞数量和单核细胞百分比。更值得关注的是,PM2.5染毒的AFLD模型小鼠BALF中炎性细胞因子及白细胞数量和单核细胞百分比的增加均显著高于PM2.5染毒的C57BL/6J小鼠,这进一步提示AFLD小鼠对 PM2.5的毒性更易感。基于本课题组的前期研究,发现:慢性PM2.5暴露能激活小鼠肺组织NLRP3炎性小体,最终导致肺炎症发生[17]。为探寻急性PM2.5暴露导致肺急性损伤的分子机制,本研究进一步评估了急性PM2.5暴露对C57BL/6J小鼠和AFLD小鼠肺组织炎性小体组成蛋白表达水平的影响。NLRP3炎性小体是先天免疫系统受体(即模式识别受体)的一种,其由NLRP3蛋白、丝氨酸蛋白酶Caspase-1和衔接分子凋亡相关斑点样蛋白(ASC)组成[18-19]。NLRP3炎性体经过多步骤过程激活后分泌IL-1β;IL-1β会导致发热,促进T细胞存活、B细胞增殖和抗体产生,募集巨噬细胞和中性粒细胞等以诱发炎症过程[20-22]。本研究发现,急性PM2.5暴露能显著增加C57BL/6J小鼠和AFLD模 型 小 鼠 肺 组 织NLRP3、ASC和Caspase-1的mRNA表达水平,并且PM2.5染毒的AFLD模型小鼠上述关键基因的mRNA表达增加的更显著,这表明急性PM2.5暴露能激活肺组织NLRP3炎性小体,并且AFLD模型小鼠肺NLRP3炎性小体变化更显著。

综上所述,急性PM2.5暴露能激活NLRP3炎性小体并导致肺组织炎症发生;此外,AFLD患者对PM2.5的毒性易感,这提示AFLD患者是PM2.5毒性损伤的易感人群,并且NLRP3炎性小体可能是防治PM2.5所致急性肺损伤的新药物靶点。