范秋雨，武建文，李焕荣

(北京农学院动物科学技术学院，动物类国家级实验教学示范中心，北京 102206)

槐花为豆科植物槐(SophorajaponicaL.)的干燥花蕾及花，又名槐米、洋槐花，植物槐被誉为“中国学者树”，是中国卫生健康部门首批公布的药食两用型花卉植物[1]。中国是药用植物槐花的原产地及主要出口国，槐米资源丰富，既可食用又是一味良药。槐花味苦，微寒，归肝、大肠经，具有凉血止血、清肝泻火功能，用于便血、痔疮出血、崩漏、吐血、肝热目赤、血痢、头晕等症[2]。不同炮制方式的槐花具有不同的功效，如槐花炭的凉血作用微弱，止血作用强[3]。

槐花的活性成分有植物甾类、鞣质、槲皮素[4]、山奈酚、异黄酮，异鼠李素、染料木素、芦丁[5]等多种黄酮类化合物。槐花有抑制血小板聚集[6]、抗氧化[7]和抗炎[8]等功能，可增加毛细血管的稳定性，降低毛细血管的通透性和血管的脆性，减少患者因糖尿病合并高血压出现的脑出血现象[9]。此外，槐花中的芳香甙能显著抑制大鼠创伤性脚爪浮肿和阻止肺水肿、结膜炎的发生[10]。黄敏[11]研究结果显示，复方槐花口服液除具有镇痛、止血及抗局部感染的作用之外，还能抑制二甲苯所致的小鼠耳廓的炎症肿胀。但槐花的主要作用成分、靶点和抗炎机制尚未明确。

鉴于此，本研究拟借助网络药理学方法，全面、系统地分析药用槐花的主要活性成分、作用靶点、信号通路及抗炎作用机制，探究其潜在网络化关联，以期为进一步阐明槐花抗炎机制提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 槐花潜在活性成分及作用靶点筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台(traditional Chinese medicine database and analysis platform，TCMSP，https:∥tcmsp-e.com/)检索槐花的全部化合物成分及对应靶点[12]，以口服生物利用度(oral bio-availability，OB)≥30%和类药性(drug likeness，DL)≥0.18作为筛选条件[13]，筛选槐花有效成分及对应靶点。

1.2 靶点基因标准化

在蛋白质数据库Uniprot(https:∥www.uniprot.org/)中下载人类全基因名称与槐花成分对应靶点进行一一匹配，得到相应靶点标准化的基因名称，将活性成分和靶点基因导入Cytoscape 3.6.1软件，以构建活性成分-靶点网络图[14]。

1.3 抗炎靶点筛选及有效成分-靶点网络图构建

在NCBI(https:∥www.ncbi.nlm.nih.gov/)、GeneCards(https:∥www.genecards.org/)、OMIM(https:∥www.omim.org/)数据库中检索抗炎相关的靶蛋白。提取槐花成分靶点与抗炎靶点的共有基因作为核心靶点，再将筛选出的活性成分及其作用的核心靶点导入Cytoscape 3.6.1软件，构建成分-抗炎靶点网络图。

1.4 蛋白互作(PPI) 网络图构建

将筛选出的槐花主要靶点蛋白制表，按指引上传至STRING平台(https:∥string-db.org/)，物种设定为人，构建PPI网络图[15]。再将PPI网络图导入Cytoscape 3.6.1软件进行拓扑属性分析，利用插件“Network Analyse”的功能进行分析。度值和介数是反映一个节点在网络中重要性的指标，选取度值和介数均高于平均值的靶标作为关键靶标，分析槐花抗炎靶点之间的相互作用。

1.5 GO功能和KEGG通路富集分析

利用DAVID数据库(https:∥david.ncifcrf.gov/)对关键靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析[16]。

2 结 果

2.1 槐花潜在活性成分及作用靶点的筛选

从TCMSP数据库中获得槐花的化学成分27种，以OB≥30%和DL≥0.18为条件筛选槐花有效成分，共获得槲皮素、异鼠李素、山奈酚、β-谷甾醇、N-[6-9-吖啶基氨基己基]苯甲酰胺、槲皮素-3-甲基醚6种活性成分，其对应靶点297个。具体信息见表1。

表1 槐花活性成分筛选结果

2.2 槐花活性成分-靶点网络图

利用UniProt数据库将TCMSP预测得到的297个靶蛋白转换为对应的靶基因，物种设定为人，得到229个标准化基因。将筛选出的6种活性成分及其作用的靶点导入Cytoscape 3.6.1软件，构建活性成分-靶点网络图。由图1可知，其包括163个节点(6种活性成分和157种相关靶点)和229条线，MOL000098(槲皮素)节点的连线最多,说明其在与靶点蛋白相互作用中起到关键作用，可能是槐花发挥药效的主要成分，其次是异鼠李素、山奈酚等物质。

图1 槐花主要有效成分-靶点网络图

2.3 抗炎靶点筛选及成分-靶点网络图构建结果

从NCBI、GeneCards、OMIM数据库里以“Anti-inflammatory”为关键词搜索抗炎基因，共找到10 030个抗炎基因。将229个槐花靶基因与10 030个抗炎相关基因映射后，得到共同靶基因221个，即为槐花抗炎作用靶点。运用Cytoscape 3.6.1软件将6种活性成分及221个靶基因建立的活性成分-靶点网络图，共获得165个节点、387条边(图2)，充分体现了槐花多成分、多靶点的作用机制。

图2 槐花有效成分-抗炎靶点网络图

2.4 靶点PPI结果

由图3可知，映射得到的221个靶基因构建的PPI网络中包含152个节点和2 579条相互作用连线。PPI网络平均度值为33.9，平均介数为0.638。据网络拓扑学参数，共筛选出34个度值和介数均超过平均值的关键靶蛋白(IL10、NFKBIA、ICAM1、MMP2、BCL2L1、STAT1、VCAM1、IFNG、MAPK14、IL2、SERPINE1、CASP9、IKBKB、GSK3B、CRP、IL1A、MMP3、MPO、MMP1、NOS2、SELE、SPP1、PRKCA、CDKN1A、CXCL10、CCNB1、CD40LG、ESR2、HSPB1、RUNX2、CHUK、RB1、RAF1和IGFBP3)，即这34个靶点为槐花发挥抗炎作用的关键靶点。

圆圈代表目标蛋白质，直线代表蛋白质之间相互作用；两个蛋白质相互作用越强，其连线越粗；不同颜色和形状的线表示不同的相互作用

2.5 GO功能和KEGG通路富集分析

使用DAVID 6.8平台对筛选出的6个槐花抗炎活性关键靶点进行GO功能和KEGG通路富集分析，GO功能富集分析得到GO条目24个(P<0.01)，其中与生物过程相关的条目16个，即RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、正调控转录DNA模板、凋亡过程的负调控、基因表达的正调控、炎症反应和细胞对脂多糖的反应等；与分子功能相关的条目6个，即酶结合、转录因子结合、蛋白结合等；与细胞组分相关的条目2个，即细胞外间隙和细胞质基质(图4)，KEGG信号通路21条(P<0.01，表2)，其中关键靶点基因与癌症、乙型肝炎、HTLV-Ⅰ感染、甲型流感等信号通路密切相关。KEGG信号通路富集分析表明其他相关信号通路为TNF信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路、NOD样受体信号通路(图5)。

图4 槐花活性关键靶点GO功能分类

表2 槐花抗炎活性关键靶点相关KEGG信号通路

续表

3 讨 论

槐花是一种具有凉血止血、清肝泻火[17]等功效的药食两用植物。多数药用植物的抗炎作用是对机体多环节、多途径作用的共同结果，通过激发生物体内的内在抗炎因素，提高机体免疫力从而发挥抗炎作用[18]。槲皮素、异鼠李素、皂苷类和染料木素等是槐花的主要成分，具有抗炎、抗氧化、止血、降糖、降压、增强免疫力及抗肿瘤等作用[19]。但其具体药效成分及作用机理并不完全清楚。

本研究釆用网络药理学的方法对槐花的主要活性成分、作用靶点、相关生物信号通路等几个方面的关联性进行探讨，发现槐花中的槲皮素可能是发挥药效的主要物质，其次是异鼠李素、山奈酚等。研究表明，槲皮素具有抗炎[20]、抗氧化、抗肿瘤等广泛的生理活性，可通过抑制NF-κB和Akt信号转导通路而影响炎症因子的表达，发挥抗炎作用[21]；此外，槲皮素可下调脂多糖(LPS)刺激的小胶质细胞炎症因子[22]。异鼠李素作为槲皮素的直接衍生物，多存在于沙棘中，具有良好的抗炎、抗氧化、抗过敏等作用[23]，而其延缓LPS炎症作用是通过NF-κB信号通路实现的[24]。山奈酚具有抗炎镇痛的作用[25]。β-谷甾醇与阿司匹林联合使用比单独使用阿司匹林的抗炎效果更强[26]。说明槐花可能通过多成分联合作用发挥抗炎活性。

通过槐花中多成分、多靶点、多通路作用于炎症代谢多个途径及炎症发生发展的多个过程分析显示，槐花抗炎作用主要涉及细胞因子、转录因子、抑制因子、趋化因子、蛋白(血管细胞黏附蛋白、急性相蛋白、E选择素、热休克蛋白、生长因子结合蛋白等)、酶等152个靶点。其中IL10是主要的免疫调节细胞因子，限制炎症引起的过度组织破坏[27]。IL2可活化T细胞产生细胞因子，刺激机体产生抗体，同时能增强单核巨噬细胞系统的功能，间接发挥抗炎作用[28]。VCAM1是一种重要的细胞黏附因子，参与细胞的增殖分化等[29]。STAT1主要通过激活IFN参与表达细胞增殖分化相关的基因，激活机体的免疫系统，清除病原体[30]。NOS2是诱导型一氧化氮合酶，能促进一氧化氮的产生，作为炎症介质广泛参与炎症、哮喘等疾病的病理发展过程[31]。CXCL10是一种趋化因子，参与周围免疫细胞的趋化、分化和激活、细胞生长调节、凋亡和血管抑制效应的调节等多种过程[32]。CHUK丝氨酸激酶在NF-κB信号负反馈中发挥关键作用，限制炎症基因的激活[33]。由此可见，槐花可能通过作用于这些关键靶点以实现其抗炎目的。

利用DAVID数据库对槐花抗炎关键靶标基于生物过程、分子功能和细胞组分进行GO功能分析，显示这些靶标主要分布在细胞外、细胞质、膜结合囊泡、核周区域等部位，与蛋白、脂肪酸、受体结合，调节蛋白激酶的活性，参与机体对多种物质刺激的反应过程。如可能参与RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控、正调控转录DNA模板、凋亡过程的负调控、药物反应、炎症反应、基因表达的正调控和对LPS反应等作用。

对靶点进行KEGG通路分析发现，TNF信号通路、Toll样受体信号通路、T细胞受体信号通路和NOD样受体信号通路为槐花抗炎的关键通路。TNF是一种重要的细胞因子，可诱导多种细胞内信号通路，包括凋亡、细胞存活及炎症和免疫。TNFR1几乎在所有细胞中表达，是TNF(也称为TNF-α)的主要受体[34]，通过NF-κB途径和MAPK级联诱导许多基因的激活，调控细胞凋亡和坏死[35]。TNFR2可在多种免疫细胞中表达，是TNF和LTA(也称为TNF-β)的受体[36]。Toll样受体是一种模式识别受体，其MyD88依赖途径通过快速激活NF-κB和MAPK产生促炎细胞因子[37]，而MyD88独立途径通过诱导IFN-β基因，缓慢激活NF-κB和MAPK诱导树突状细胞成熟[38]。NOD样受体是特定的模式识别受体，识别各种病原体并产生先天免疫反应。NOD1和NOD2是2个典型的NLR，能驱动NF-κB和MAPK的激活，细胞因子的产生和凋亡[39]。不同的NLR通过炎症小体的多蛋白复合物的组装诱导Caspase-1激活[40]，调节促炎细胞因子IL1β、IL18的成熟并驱动焦亡[41]。以上分析表明槐花可能通过多层次、多途径实现抗炎作用，但其具体的抗炎机制仍需进一步的验证。

4 结 论

本研究结果表明，槐花通过多成分、多靶点、多通路参与机体抗炎的反应过程。该分析为阐明其抗炎成分及作用机制提供了一定的理论基础，为槐花的进一步开发应用提供科学依据。