冯小品，李隐侠，张晨俭，张 俊，孟春花，钱 勇，曹少先

(1.江苏省农业科学院畜牧研究所，南京 210014；2.江苏省农业种质资源保护与利用平台，南京 210014;3.农业农村部种养结合重点实验室，南京 210014)

多型性腺瘤基因1 (pleomorphic adenoma gene 1，PLAG1)属于多形性腺瘤基因家族成员之一，是一种锌指转录因子，早期研究认为仅可促进多形性腺瘤的发生[1]，后来陆续发现PLAG1能促进脂肪母细胞瘤、肝母细胞瘤等多种肿瘤的发生，其机制是PLAG1发生强启动子替换后表达上调，通过与胰岛素样生长因子2(insulin-like growth factor 2，IGF2)启动子结合上调IGF2表达，促进肿瘤细胞的增殖与抗凋亡[2-3]。研究发现，PLAG1基因敲除小鼠胎儿生长发育受到抑制[4]；PLAG1基因外显子的移码突变导致编码蛋白变短后引起人胎儿出生重和身高下降[5]，提示PLAG1参与调控胎儿生长发育。此外，PLAG1基因突变还与家畜的体重、体尺和屠宰性状相关联，湖羊PLAG1基因启动子区存在4个紧密连锁位点，且与出生体重和断奶体重均显著相关[6]；牛PLAG1基因邻近区域的1个数量性状核苷酸序列(quantitative trait nucleotides,QTN)与腿肌重、日增重、体长和胴体性状相关联[7-8]，且其SNPs位点影响牛早期体重、6～8月龄体重等生长性状[9]。目前，波尔山羊的PLAG1基因序列尚未被克隆，其多态性与其早期生长发育性状的关联分析鲜见报道。本试验以波尔山羊为对象，克隆PLAG1基因序列，鉴定其在不同年龄和出生体重波尔山羊组织中的表达模式，筛选波尔山羊PLAG1基因SNP位点，并与出生羔羊的生长指标(出生体重、出生体长、出生体高、出生胸围和出生管围)进行关联分析，以期为山羊的早期分子育种提供候选分子标记。

1 材料与方法

1.1 材料

217只波尔山羊羔羊及其生长性状(出生体重、出生体长、出生胸围和出生管围等按照常规方法测定)相关资料均由江苏省农业科学院六合动物实验基地提供。试验羊在相同饲养环境和营养水平下统一管理。采集试验羊耳组织置于冻存管中，用冰桶带回实验室，―20 ℃保存备用。随机挑选6只初生羔羊，按照体重大小分为2组：一组出生体重分别为2.6、2.5和2.4 kg，平均出生体重为2.5 kg，为出生体重较高组；另一组出生体重分别为2.3、2.1和1.9 kg，平均出生体重为2.1 kg，为出生体重较低组，两组羊出生体重差异显著(P<0.05)。选取1岁母羊和120日龄胎羊各3只，屠宰后取心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、睾丸、腿肌、小肠等组织于冻存管后立即放于液氮中，带回实验室―80 ℃保存备用。

1.2 主要试剂

RNA提取试剂盒(北京百泰克生物技术有限公司)；逆转录试剂盒、2×TaqMasterMix、Real-time PCR试剂盒、琼脂糖(南京诺唯赞生物科技有限公司)；BCA试剂盒(上海碧云天生物技术有限公司)；蛋白抗体PLAG1(#H0000532，Abnova公司)；β-tubulin(#11224-1-AP，Proteintech公司)。

1.3 DNA、RNA提取和反转录

采用酚/氯仿法提取波尔山羊耳组织DNA，采用RNA提取试剂盒提取组织总RNA，使用分光光度计测定RNA浓度与纯度，使用逆转录试剂盒将RNA逆转录为cDNA，―20 ℃保存备用。

1.4 引物设计与合成

根据NCBI数据库中山羊PLAG1基因预测序列(GenBank登录号：XM_005688991.3)，利用Primer Primier 5.0软件设计特异性引物，用于波尔山羊PLAG1基因CDS、3′-UTR区序列扩增及SNP筛选，并设计PLAG1基因定量引物，以β-actin(GenBank登录号：NM_001314342)为内参基因，鉴定波尔山羊各组织中PLAG1基因表达量，引物信息见表1。引物均由上海捷瑞生物工程有限公司合成。

表1 引物信息

1.5 PCR扩增及克隆测序

以波尔山羊腿肌cDNA为模板，利用P1、P2 2对引物通过巢式PCR对PLAG1基因CDS区进行扩增，利用引物P5对PLAG1基因3′-UTR区序列进行扩增。PCR扩增体系20 μL：2×TaqMasterMix (Dye Plus) 12.5 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，灭菌水补足体系。PCR反应程序：95 ℃预变性5 min；95 ℃变性30 s，58/60 ℃退火30 s，72 ℃延伸100 s，共35个循环；72 ℃延伸5 min。PCR扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测。将纯化回收的DNA与pMD19-T克隆载体于16 ℃连接过夜，连接产物转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，涂于含Amp抗性的LB平板，37 ℃培养过夜，挑取单克隆菌落培养，阳性菌液经PCR鉴定(用引物P2进行菌液PCR鉴定)后送南京擎科生物有限公司测序。

1.6 序列分析

用DNAMAN 6.0和DNAStar软件进行氨基酸序列翻译及与其他物种序列比对，同源序列用NCBI BLAST进行搜索，使用NCBI的ORF Finder(http:∥www.ncbi.nih.gov/projects/gorf)进行开放阅读框预测。

1.7 实时荧光定量PCR和Western blotting

以β-actin为内参，采用实时荧光定量PCR方法检测不同出生体重波尔山羊羔羊、胎羊和成年母羊心脏、肝脏、脾脏、睾丸、小肠和骨骼肌组织中PLAG1基因的表达水平。PCR反应体系20 μL：cDNA 2.0 μL，2×ChamQ SYBR qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各0.4 μL，ddH2O 7.2 μL。PCR反应条件：95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 30 s，共40个循环；95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，95 ℃ 15 s。定量结果采用2―△△Ct法进行处理分析。

分别提取不同体重羔羊腿肌总蛋白，BCA方法测定蛋白浓度。参照李隐侠等[10]方法进行Western blotting试验，使用Image J软件进行条带密度分析。

1.8 PLAG1基因在波尔山羊群体中SNPs鉴定及基因分型

随机挑选30个波尔山羊耳组织DNA样，每5个DNA样混为1个DNA池。以混池DNA为模板，利用P1、P2和P5引物进行PLAG1基因CDS和3′-UTR区序列扩增，PCR扩增程序同1.5，PCR扩增产物送南京擎科生物科技有限公司测序。测序结果经Chromas 2.3软件分析，查找SNPs位点，再对217只波尔山羊进行PCR扩增、测序和基因分型，统计不同基因型在波尔山羊群体中的基因频率、基因型频率、多态信息含量(polymorphism information content,PIC)、杂合度(heterozygosity,He)等指标。

1.9 数据分析

利用SPSS 19.0软件中单因素方差分析(One-Way ANOVA)对PLAG1基因各SNP位点不同基因型与波尔山羊出生体重、出生体长、出生胸围和出生管围进行关联分析，数据以平均值±标准差表示。P<0.05为差异显著；P<0.01为差异极显著。

2 结 果

2.1 PLAG1基因CDS和3′-UTR区序列扩增

以波尔山羊腿肌cDNA为模板，以P1和P2为引物，采用巢式PCR方法扩增波尔山羊PLAG1基因CDS区，经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，巢式PCR扩增产物呈现单一DNA条带，片段大小约为1 596 bp(图1A)，与预期片段大小一致。对鉴定正确的产物切胶回收后克隆测序，对所获序列进行比对，获得山羊PLAG1基因CDS区全长序列；以P5为引物扩增波尔山羊PLAG1基因3′-UTR序列，获得长约1 689 bp的片段(图1B)，与预期大小一致。两段序列与GenBank数据库中山羊PLAG1基因预测序列(登录号：XM_013969222)的相似性均为100%。

2.2 波尔山羊PLAG1序列分析

序列分析发现，波尔山羊PLAG1基因CDS区全长1 500 bp，A、T、G、C含量分别为24.07%、18.60%、25.33%和32.00%，其中GC含量为57.33%，AT含量为42.67%，共编码499个氨基酸。DNAMAN软件比对发现，波尔山羊PLAG1基因CDS区序列与人(登录号：NM_001114634)、猪(登录号：XM_021089354)、牛(登录号：XM_005215432)、绵羊(登录号：XM_012183720.2)等哺乳动物的核苷酸序列相似性分别为85.6%、91.6%、98.6%和99.2%，氨基酸序列相似性分别为96.4%、95.2%、99.8%和99.8%(表2)。山羊与绵羊、牛的氨基酸序列相似性最高，均在第366位氨基酸处有差别，绵羊和牛为缬氨酸，而山羊为蛋氨酸，说明在哺乳动物中PLAG1蛋白非常保守。

表2 波尔山羊与其他哺乳动物间PLAG1基因核苷酸和氨基酸序列相似性

2.3 山羊PLAG1基因的组织表达模式

实时荧光定量PCR检测发现，PLAG1基因在出生体重较大的羔羊心脏、肝脏、脾脏、睾丸、小肠和腿肌中的表达水平高于出生体重较小的羔羊组织，其中心脏和腿肌中表达量差异显著(P<0.05)，小肠中表达量差异极显著(P<0.01)(图2)。出生体重较大的羔羊腿肌中PLAG1蛋白表达水平极显著高于羔羊体重较小羔羊(P<0.01，图3)。PLAG1基因在成年母羊各组织中的表达水平普遍偏低，均显著或极显著低于妊娠末期胎羊各组织(P<0.05；P<0.01，图4)。

*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)。下同

图3 PLAG1蛋白在不同出生体重羔羊腿肌中的表达量

图4 PLAG1基因在胎羊和成年母羊各组织中的表达量

2.4 波尔山羊PLAG1基因SNP位点筛选

利用P1、P2和P5引物扩增波尔山羊群体PLAG1基因序列，PCR扩增产物测序后经Chromas 2.3软件分析，在PLAG1基因3′-UTR区序列中共检测到6个SNPs位点，按照SNPs位点与GenBank数据库中预测的山羊PLAG1基因mRNA序列(登录号：XM_013969222.2)起始密码子的距离分别命名为：2664 A>G、2712 A>G、2721 T>C、2879 T>A、2990 A>T和3270 A>G(图5)。

图5 波尔山羊PLAG1基因SNPs位点测序图

2.5 PLAG1基因SNPs位点基因频率和基因型频率

由表3可知，在217只波尔山羊样本中，6个SNPs位点均被检测到3种基因型，其中，2664 A>G、2712 A>G、2990 A>T、3270 A>G位点的优势等位基因均为A，基因频率分别为68.9%、74.2%、91.5%和77.7%；2721 T>C和2879 T>A位点优势等位基因均为T，基因频率分别为71.4%和68.7%；除2990 A>T位点多态信息含量为低度多态外(PIC<0.25)，其余5个位点均为中度多态(0.25G位点偏离哈迪-温伯格平衡状态外(P<0.05)，其余5个位点均处于哈迪-温伯格平衡状态(P>0.05)。

表3 波尔山羊PLAG1基因SNPs位点基因型频率、基因频率及遗传多样性

2.6 PLAG1基因SNPs位点不同基因型与波尔山羊出生体重、体尺的关联分析

由表4可知，在217只波尔山羊样本中，2664 A>G位点AG基因型个体出生管围显著大于GG型(P<0.05)；2721 T>C位点TT基因型个体出生体长显著大于TC基因型(P<0.05)，TT基因型个体出生体重有大于TC基因型个体的趋势，提示T等位基因对体长和体重的增加更有利；2879 T>A位点TA基因型个体出生管围显著大于AA基因型(P<0.05)；2990 A>T位点AA基因型个体出生体重显著大于AT基因型(P<0.05)，AA基因型个体在体尺性状上虽然与AT、TT基因型差异不显著，但有上升趋势；3270 A>G位点GG基因型个体出生体长显著大于AA基因型(P<0.05)，AG基因型个体出生胸围显著大于AA基因型(P<0.05)，GG基因型个体在体重、体高、管围3个性状上均有上升趋势，提示G等位基因对波尔山羊生长有利；其余位点各指标差异均不显著(P>0.05)。

表4 PLAG1基因SNPs位点各基因型与波尔山羊出生体重、体尺的关联分析

3 讨 论

3.1 PLAG1序列及组织表达特征

研究表明，序列高度一致的蛋白质其结构和功能高度相似[11]。Sousounis等[12]研究发现，在分子进化过程中，蛋白质的结构越保守其功能也越保守。本研究获得波尔山羊PLAG1基因CDS区全长1 500 bp，编码499个氨基酸。序列比对发现，PLAG1蛋白在哺乳动物间相似性达到95.2%以上，与牛和绵羊的相似性均为99.8%，说明PLAG1蛋白在哺乳动物进化过程中非常保守。研究发现，敲除PLAG1基因可导致小鼠胎儿生长发育受阻[4]，PLAG1基因突变影响牛、猪和绵羊的生长和屠宰性状[7，13-14]，提示PLAG1基因可能在波尔山羊生长发育中发挥十分重要的功能。PLAG1基因在胚胎期的表达量较高，而在大多数成体器官中的表达量较低或不表达[5]。PLAG1基因主要在人胚胎组织中表达，而在成人组织如心脏、脑、肺脏、肝脏、骨骼肌和胰腺中的表达量较低[1]。成年小鼠PLAG1基因转录本在脑、胸腺、胃、肠、脾脏、前列腺、骨骼肌、肾脏、唾液腺、子宫、舌、肺脏和肝脏中的表达量均低于检测限[1]。本试验结果显示，不同出生体重羔羊PLAG1基因在心脏、小肠和腿肌组织中呈差异表达，提示PLAG1基因可能通过调控肌肉发育影响羔羊体重，而胎羊心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏、小肠和腿肌组织中的表达量均显著或极显著高于成年母羊，说明山羊组织中PLAG1基因的表达模式与小鼠和人相似，在胎儿期表达量较高，出生后随着年龄增加表达量逐渐降低。

3.2 PLAG1基因与动物生长的关系

Hensen等[4]研究发现，PLAG1基因缺失小鼠体型较小：从胚胎期11.5 d开始，PLAG1基因缺失小鼠胚胎比同窝对照组胚胎小约18%；出生时，PLAG1基因缺失小鼠幼仔仅占同窝野生型小鼠体重的70%；出生后21 d，PLAG1基因缺失小鼠体重比同窝对照组小约50%，说明PLAG1基因敲除使小鼠胚胎期和出生后生长受阻。本试验发现，PLAG1基因表达水平与波尔山羊出生体重呈显著关联，出生体重较大的羔羊心脏、肝脏、脾脏、睾丸、小肠、腿肌组织中PLAG1基因表达量均大于出生体重较小的羔羊，其中心脏和腿肌中表达量差异显著，小肠中表达量差异极显著；出生体重较大的羔羊腿肌中PLAG1基因表达量极显著高于出生体重较小的羔羊，这与Hensen等[4]研究结果相似，提示PLAG1基因表达与羔羊体重相关，为进一步研究PLAG1基因对山羊生长性状的影响提供了依据。

大量研究表明，PLAG1基因在动物的生长调控中起关键作用，在猪、牛、马、绵羊中均已发现与体尺、体重性状相关的SNPs[6,8,15-17]；PLAG1基因是影响猪平均背脂厚、肢骨长的候选基因[18-19]，与猪的脊椎数呈显著相关，从而影响猪的体长性状[20]。Utsunomiya等[13]研究发现，现代牛体长的恢复主要受到PLAG1基因单倍型(Q)选择的影响。本研究发现，2721 T>C位点TT基因型个体出生体长显著大于TC基因型，3270 A>G位点GG基因型个体出生体长显著大于AA基因型，提示2721 T>C位点TT基因型和3270 A>G位点GG基因型可以用于波尔山羊选育，其影响体长的原因有待进一步研究。研究发现，PLAG1-NCAPG基因间隔区1个QTN与日本和牛阉牛日增重、体长、胴体性状相关[8]；PLAG1基因SNPs可影响牛早期体重及6～8月龄体重[9]；PLAG1基因中1个15 bp插入显著上调了山羊的体重和胸围[21]。本研究发现，2990 A>T位点AA基因型个体出生体重显著高于AT基因型，AA基因型个体体尺相关性状均有增加的趋势，提示2990 A>T位点AA基因型有利于增加波尔山羊体重。综上所述，PLAG1基因分子标记可用于山羊体尺和体重的选育。

4 结 论

本研究克隆获得波尔山羊PLAG1基因CDS区全长1 500 bp序列。PLAG1基因在胎羊各组织中表达水平极显著高于成年羊，PLAG1基因表达量高、低与羔羊出生体重呈显著关联。在波尔山羊群体中共筛选到6个PLAG1基因SNPs位点，其中2721 T>C位点TT基因型、2990 A>T位点AA基因型、3270 A>G位点GG基因型均为有利基因型，可显著增加波尔山羊的出生体重及体尺，表明PLAG1基因可作为候选基因用于波尔山羊早期生长选择。