高晓敏，周舒简，陈 晨，金 晶，胡 菜，张 晨，左其生，张亚妮，陈国宏，李碧春，2

(1.扬州大学动物科学与技术学院，中国教育部国际农业与农产品安全研究联合实验室，扬州 225009；2.江苏科技大学生物技术学院，镇江 212003)

长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一种不编码蛋白质的RNA，在表观遗传、转录和转录后水平调控基因表达中发挥着重要作用[1]。近年来研究表明，lncRNA广泛参与生命活动，包括细胞增殖、分化、凋亡[2]，以及胚胎发育。因此，lncRNA的功能和调控机制的阐明对现代生命科学具有重要意义。原始生殖细胞是精子和卵子的祖细胞，鸡原始生殖细胞(primordial germ cells，PGCs)有随血液迁移的特点，受许多转录调控因素的调节。随着高通量测序技术的发展，lncRNA在调控生殖细胞分化中起着非常重要的作用[3]。骨形态发生蛋白4(bone morphogenetic protein，BMP4)可诱导人胚胎干细胞(embryonic stem cells，ESCs)分化为生殖细胞，在胚胎干细胞培养液中加入BMP4可以导致生殖细胞标志物的表达[4]。本研究前期通过分析筛选鸡ESCs、PGCs、精原干细胞(spermatogonial stem cells，SSCs)转录组测序结果，发现一条lncRNA(TCONS_00874170)，预测其靶基因为BMP4，将其命名为lncRNA-BMP4[5]。其在PGCs上特异性高表达，但其表达调控机制并不清楚。lncRNA的表达具有时空特异性，而导致其特异性的主要原因是启动子的活性不同[6]。

转录因子和表观遗传修饰是影响启动子活性的主要因素[7]。Wang等[8]研究发现，lncTCF7的启动子区能与SWI/SNF复合物结合调节其表达，从而激活Wnt信号。除转录因子的影响外，表观遗传因素也会影响lncRNA启动子的转录活性。DNA甲基化主要是与转录抑制有关的表观遗传修饰类型[9]。一些lncRNAs是通过其启动子区域CpG位点的甲基化缺失而被表观激活的[10]。研究表明，组蛋白乙酰化修饰是基因表观转录调控的重要机制[11]。组蛋白H3k27乙酰化激活lncRNA PAXIP1-AS1可影响卵巢癌的发生[12]。多种物质可通过调控组蛋白乙酰化水平影响lncRNA的表达[13]。鉴于此，本研究通过双荧光素酶报告系统确定lncRNA-BMP4的核心启动子区域，并通过顺反式验证了影响启动子核心区域表达的因素，以期为系统解析影响lncRNA的表达因素提供新思路，为详细解析lncRNA-BMP4的功能和分子机制奠定理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料

限制性内切酶AseⅠ、XhoⅠ、Hind Ⅲ及2×SuperReal Color、PreMix Prime STAR Mix均购自TaKaRa公司；1×抗真菌/抗菌剂(100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)购自Invitrogen公司；胰酶、高糖DMEM、10%胎牛血清(FBS)均购自Gibco公司；血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)、TRNzol Universal总RNA提取试剂(DP424)、FastKing一步法反转录-荧光定量试剂盒(SYBR Green，FP313)均购自天根生化科技(北京)有限公司；FuGENE®HD(E2311)和双荧光素酶报告基因检测系统均购自Promega公司；超级感受态、引物合成及测序均由北京擎科生物公司完成。pGL3-Basic载体、pEGFP-N1载体、鸡成纤维细胞系(DF-1)均由中国教育部国际农业与农产品安全研究联合实验室保存。

超低温离心机、超低温冰箱、荧光酶标仪和细胞培养箱均购自Thermo公司；荧光倒置显微镜购自Olympus公司；荧光定量PCR仪、凝胶成像系统均购自Bio-Rad公司；水浴锅购自上海精宏实验设备有限公司。

1.2 lncRNA-BMP4启动子克隆

根据软件Softberry(http:∥linux1.softberry.com/berry.phtml topic=service)预测的lncRNA-BMP4启动子序列设计启动子全长扩增引物，引物序列为：F:5′-CCCATTAATGAGCCACTCTGTT-TCGCATT-3′(下划线处为AseⅠ酶切位点)；R:5′-CCCAAGCTTACCACTGAGCCATTCTTGGA-3′(下划线处为Hind Ⅲ酶切位点)。引物由北京擎科生物科技有限公司合成。

通过血液/细胞/组织基因组DNA提取试剂盒(DP304)提取鸡肌肉基因组DNA，并以此为模板进行PCR扩增。PCR扩增体系20 μL：Prime STAR Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，模板1 μL，ddH2O 7 μL。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共35个循环；72 ℃延伸7 min。1.0%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。将鉴定正确的lncRNA-BMP4的PCR扩增产物回收纯化后与pEGFP-N1载体连接，经AseⅠ和Hind Ⅲ双酶切，酶切鉴定正确后交于北京擎科生物公司测序，构建plncBMP4-N1载体。

1.3 lncRNA-BMP4启动子系列缺失载体构建

以lncRNA-BMP4全长为模板，固定3′-端逐步缩短5′-端，分别设计启动子不同缺失片段的引物，引物信息见表1。PCR扩增体系及程序同1.2。PCR扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳后进行目的产物纯化回收，经XhoⅠ和Hind Ⅲ双酶切后连接到无启动子的pGL3-Basic载体中，连接产物转化超级感受态细胞，挑取阳性单克隆菌落进一步测序鉴定，构建鸡lncRNA-BMP4的一系列5′-端缺失载体(图1)。筛选到核心区域后，采用相同方法分别构建全长启动子核心区域缺失的载体pGL3-DE-p4-p5，以及只含有核心区域的载体pGL3-p4-p5。将这2个载体与8个缺失载体分别转染DF-1细胞，并进行双荧光素报告基因检测，进一步确定启动核心区域位置。

表1 lncRNA-BMP4扩增引物序列

图1 lncRNA-BMP4启动子系列缺失载体引物设计模式图

1.4 生物信息学分析

通过转录因子预测网站 Jaspar(http:∥jaspar.genereg.net/cgi-bin/jaspar_db.pl)预测lncRNA-BMP4核心启动子区域可能发挥作用的转录因子，分别为性别决定区Y的盒内基因17(SOX17)、环磷腺苷效应元件结合蛋白1(CREB1)、信号转导与转录激活因子1(STAT1)。运用MethPrimer软件对lncRNA-BMP4启动子区进行分析，预测CpG岛。使用GC含量在线计算网站(http:∥www.detaibio.com/tools/gc-content.html)对其启动子区的GC含量进行分析。

1.5 点突变试验

在pGL3-p4-p5质粒基础上分别将SOX17、CREB1、STAT1转录因子结合位点缺失，重新插入pGL3-Basic载体中，命名为pGL3-SOX17 mut、pGL3-CREB1 mut和pGL3-STAT1 mut。将pGL3-p4-p5、3个突变载体与内参质粒sv40共转染DF-1细胞。转染48 h后，收集细胞样品进行双荧光素酶活性验证，比较SOX17、CREB1、STAT1转录因子结合位点突变后是否影响lncRNA-BMP4的启动子活性。

1.6 STAT1干扰载体构建

根据NCBI中鸡STAT1基因序列(登录号：NM_001012914.2)设计3条干扰序列及1条阴性对照序列(shNC)。将干扰靶点反向互补拼接，在其中插入Loop环(TTCAAGAGA)，然后在上、下游引物的5′-端分别引入BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切位点，并在上游引物的3′-端插入AAAAAA，在下游引物的5′-端加入TTTTTT，形成shRNA Oligo，序列见表2。取shRNA Oligo上、下游引物各5 μL进行退火。退火程序：95 ℃ 30 s，72 ℃ 2 min，37 ℃ 2 min，25 ℃ 2 min。退火产物连接到经BamH Ⅰ和EcoR Ⅰ酶切的pGLMV-SC5干扰载体上，重组载体分别命名为shSTAT1-1、shSTAT1-2和shSTAT1-3。

表2 转录因子STAT1干扰载体引物

续表

1.7 细胞转染

在37 ℃、5% CO2细胞培养箱中用含10%胎牛血清和1×抗真菌/抗菌剂(100 μg/mL青霉素、100 μg/mL链霉素)的DMEM高糖培养基培养DF-1细胞。将DF-1细胞以1×105/孔均匀地铺在24孔板中，24 h后观察细胞生长状态，选择生长状态良好且汇合度达70%左右时细胞进行质粒转染。将目的质粒1 μg、sv40内参质粒30 ng、Opti-MEM补足50 μL与3 μL FUGENE、47 μL Opti-MEM混匀至100 μL，37 ℃孵育15 min。在每个孔中轻轻加入100 μL转染混合液，48 h后观察荧光表达并拍照。

1.8 双荧光素酶活性检测

按照双荧光素酶试剂盒操作步骤收集1.7中的细胞，去掉培养液，用预冷的1×PBS洗涤细胞。胰酶消化后转移到1.5 mL离心管，离心弃上清，在每管中加入70 μL稀释过的裂解液，重悬细胞后，室温静置10 min，再转移到96孔酶标板中；设置好荧光参数后，分别在每个样品孔中加入70 μL萤火虫荧光液，于酶标仪中读取550 nm下的萤火虫荧光值；结束后再在板中加入同等体积的STOP液，淬灭萤火虫荧光，激活海参荧光，于酶标仪中读取480 nm下的海参荧光值。萤火虫荧光值/海肾荧光值即为启动子活性。所有试验均进行3个独立重复。

1.9 实时荧光定量PCR检测STAT1基因表达量

收集分别转染shSTAT1-1、shSTAT1-2和shSTAT1-3的DF-1细胞，以不转染组为空白对照，以转染pGLMV-SC5-Negative组为阴性对照(NC)，用Trizol法提取总RNA后反转录合成cDNA。PCR反应体系20 μL：2×SuperReal Color PreMix 10 μL，cDNA模板2 μL，上、下游引物(10 μmol/L)各0.6 μL，RNase-free ddH2O 6.8 μL。PCR反应程序：95 ℃预变性10 min；95 ℃变性15 s，65 ℃退火延伸30 s，共40个循环。

1.10 表观遗传修饰对lncRNA-BMP4启动活性的影响

为了探究组蛋白乙酰化是否影响lncRNA-BMP4的转录水平，将核心启动子转染DF-1细胞后，添加终浓度为1 μmol/L的曲古抑菌素(trichostatin，TSA)，与同处理但不加TSA做对比，以转染pGL3-Basic载体为空白对照。处理48 h后，各组收样进行双荧光素酶检测组蛋白乙酰化对 lncRNA-BMP4启动子转录活性的影响。

为了探究DNA甲基化是否影响lncRNA-BMP4的转录水平，将核心启动子转染DF-1细胞后，添加终浓度为10 μmol/L的5′-Azadc(5′-Aza-2′-deoxycytidine)，与同处理但不加5′-Azacd做对比，以转染pGL3-Basic载体为空白对照。处理48 h后，各组收样进行双荧光素酶检测DNA甲基化对lncRNA-BMP4启动子转录活性的影响。

1.11 统计分析

根据公式2―ΔΔCt计算相对表达量，统计学处理采用单因素方差分析(One-Way ANOVA)检验，并利用GraphPad Prism 9.0软件进行作图。结果以平均值±标准误表示，P<0.05表示差异显著；P<0.01表示差异极显著。

2 结 果

2.1 lncRNA-BMP4启动子活性定性分析

通过PCR扩增得到1 288 bp的lncRNA-BMP4启动子片段(图2)，测序结果显示，plncBMP4-N1重组载体构建成功。将plncBMP4-N1载体转染DF-1细胞48 h后观察发现，转染了重组质粒的细胞表达绿色荧光，但其表达的亮度低于pEGFP-N1载体转染组(图3)。表明预测的lncRNA-BMP4启动子有启动活性。

M，DL5000 DNA Marker；1～8，lncRNA-BMP4启动子序列扩增

图3 plncBMP4-N1重组载体活性验证(100×)

2.2 lncRNA-BMP4启动子活性核心区域筛选

采用预设计的8对引物，以plncBMP4-N1为模板扩增系列缺失片段，电泳结果分别出现大小约为1 288、1 104、947、850、669、491、328和166 bp的8条带(图4)，均与预期大小相符，表明启动子系列缺失片段扩增成功。将系列缺失片段插入pGL3-Basic载体中，构建出8个重组荧光素缺失载体，采用双荧光素报告基因检测lncRNA-BMP4各片段启动子活性的变化，结果显示，从―1 270 bp逐步截短至―832 bp时启动子的活性未发生显著变化，而从―832 bp截短至―651 bp时启动子的活性极显著下降(P<0.01)，且在后续继续截短时启动活性未出现显著变化(图5)。初步判断―832～―651 bp为lncRNA-BMP4启动子的核心区域。

M，DL5000 DNA Marker；1～16，P1～P4片段PCR扩增产物；17～32，P5～P8片段PCR扩增产物

*，差异显著(P<0.05)；**，差异极显著(P<0.01)；无*，差异不显著(P>0.05)。下同

进一步构建只含有活性区域的pGL3-p4-p5载体和此区域完全缺失的pGL3-DE-p4-p5载体，双酶切结果显示分别切出约191和1 099 bp片段(图6)，将双酶切成功的载体送测序，结果表明2个载体均构建成功。为验证该区域是否为启动子活性核心区域，试验分别将后构建的载体转入DF-1细胞中，发现仅含有活性区域(―832～―651 bp)的pGL3-p4-p5载体启动活性极显著高于核心启动子区完全缺失的pGL3-DE-p4-p5载体(P<0.01)(图7)。说明―832～―651 bp为lncRNA-BMP4启动子的核心区域。

M，DL5000 DNA Marker；1、4，pGL3-p4-p5和pGL3-DE-p4-p5质粒；2、5，pGL3-p4-p5和pGL3-DE-p4-p5质粒单酶切；3、6，pGL3-p4-p5和pGL3-DE-p4-p5质粒双酶切

图7 双荧光素酶试验筛选启动子核心区域

2.3 lncRNA-BMP4关键转录因子的筛查

单酶切结果显示在约5 000 bp处存在目的条带，表明pGL3-SOX17 mut、pGL3-CREB1 mut和pGL3-STAT1 mut载体构建成功(图8)。将3个缺失重组载体和野生型pGL3-p4-p5载体分别转染DF-1细胞，双荧光素酶结果显示，与pGL3-p4-p5载体相比，缺失SOX17或CREB1转录因子结合位点均不能显著影响核心启动区域的活性；而缺失了STAT1转录因子结合位点的载体则极显著降低了核心启动区域活性(P<0.01)(图9)。表明STAT1是影响lncRNA-BMP4转录活性的关键转录因子。

图9 双荧光素酶验证转录因子SOX17、CREB1及STAT1的作用

2.4 关键转录因子STAT1的功能检测

本研究成功构建了3个STAT1干扰载体(shSTAT1-1、shSTAT1-2、shSTAT1-3)，对其干扰效率进行检测发现，shSTAT1-1、shSTAT1-2和shSTAT1-3与阴性对照组间差异不明显(图10)。实时荧光定量PCR结果表明，与对照组相比，shSTAT1-1、shSTAT1-3极显著干扰了STAT1的表达(P<0.01)，shSTAT1-2显著干扰了STAT1的表达(P<0.05)，且shSTAT1-1干扰作用强于shSTAT1-3(图11)。因此以shSTAT1-1干扰载体进行后续验证试验。

图10 STAT1干扰载体活性验证(100×)

图11 STAT1干扰载体效率检测

将shSTAT1-1干扰载体与启动子核心区域pGL3-p4-p5载体共转染，以单转pGL3-p4-p5为对照，双荧光素酶检测结果显示，与对照组相比，干扰STAT1后lncRNA-BMP4启动子活性核心区域的启动活性极显著下降(P<0.01)(图12)。提示转录因子STAT1能促进lncRNA-BMP4的转录。

图12 双荧光素酶验证转录因子的作用

2.5 表观遗传修饰对lncRNA-BMP4启动活性的影响

生物信息学预测发现在lncRNA-BMP4启动子区存在高GC含量(图13)。将核心启动子转染DF-1后添加DNA甲基化抑制剂5′-Azacd，与同处理但不加5′-Azacd进行对比，双荧光素酶检测结果显示，添加5′-Azacd不影响lncRNA-BMP4的转录活性(P>0.05)；将核心启动子转染DF-1细胞后，添加组蛋白去乙酰化酶抑制剂TSA，与同处理但不加TSA进行对比，双荧光素酶检测结果显示，添加TSA后极显著提高了lncRNA-BMP4的转录活性(P<0.01，图14)。

图13 lncRNA-BMP4启动子区域CpG岛(A)和GC位点(B)预测

图14 DNA甲基化和组蛋白乙酰化对lncRNA-BMP4启动活性的影响

3 讨 论

基因表达的时空顺序受多种表达调控机制，转录起始是最主要的调控方式之一，所以深入探究启动子对基因表达的影响尤为重要。本研究使用扩增的lncRNA-BMP4启动子替换pEGFP-N1载体的CMV启动子，进一步采用固定3′-端、逐段缩短5′-端的逐段截短法，构建启动子的系列缺失双荧光素酶报告载体，分别鉴定每个片段的启动活性。通过相邻2个载体的活性差异，确定了―832～―651 bp是lncRNA-BMP4启动子的活性核心区域，并在此基础上通过Jaspar网站预测了可能发挥作用的转录因子，分别为SOX17、CREB1、STAT1。

3.1 转录因子STAT1激活lncRNA-BMP4的表达

转录因子是调控基因表达的重要因素，它可以结合到基因的启动子区域，与RNA聚合酶形成复合物，来提高RNA聚合酶的转录效率。转录因子及与其结合的启动子中的相关顺式作用元件在基因表达方面起着开关作用[14]。转录因子既可以正向调控基因表达也可以抑制基因表达。研究发现，转录因子ACSL1和ASCL2可激活家族序列相似性13成员A(family with sequence similarity 13 member A，FAM13A)基因的转录[15]；转录抑制因子VIVIPAROUS1/ABI3-LIKE1(VAL1)和VAL2可抑制多梳抑制复合物2(polycomb repressive complex 2，PRC2)基因的转录[16]。转录因子是信号通路下游的效应器，通过接受信号通路的信号来启动基因的表达。研究表明，STAT1可激活lncRNA的表达[17]。本研究发现，转录因子STAT1能正向调控lncRNA-BMP4的表达，而前期研究表明，lncRNA-BMP4能够正向调节PGCs的形成[5]，而STAT1也是正向调控PGCs形成的重要转录因子[18]。综上，STAT1可通过调控lncRNA-BMP4的表达来调控PGCs发育。

3.2 DNA甲基化对lncRNA-BMP4启动子活性的影响

DNA甲基化是表观遗传修饰中调控基因表达最多的一个修饰。DNA甲基化是基因组DNA中胞嘧啶的共价修饰，在脊椎动物中主要发生在CpG二核苷酸，即CpG岛上，一般与长期转录抑制有关[19]。CpG岛位于基因的启动子区域,因此又称5′-CpG岛，与其他CpG二核苷酸不同[20]。研究发现，CpG位点甲基化可以促进多巴胺受体D2(dopamine receptor D2,DRD2)基因表达[21]；P15基因启动子区域5′-CpG岛的异常甲基化是基因失活的主要机制[22]。因此，CpG甲基化是影响基因表达的重要因素。本研究发现，在lncRNA-BMP4的启动子区域中没有发现CpG岛，但是在它的启动子区发现很多CG位点；而添加5′-Azacd发现，DNA甲基化水平的改变不影响lncRNA-BMP4的启动活性。推测CG位点可能不足以引起STAT1转录因子与启动子的结合，从而无法影响lncRNA-BMP4的启动活性。

3.3 组蛋白乙酰化正向调控lncRNA-BMP4 启动子活性

组蛋白乙酰化修饰是表观遗传学研究的重要组成部分，与基因活化密切相关[23]，它能使DNA与组蛋白八聚体的解离，核小体结构松弛，从而使各种转录因子和协同转录因子能与DNA结合位点特异性地结合，激活基因的转录。在细胞核内，组蛋白乙酰化与组蛋白去乙酰化过程处于动态平衡，并由组蛋白乙酰化转移酶(histone acetyltransferase，HAT)和组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase，HDAC)共同调控。HAT可将乙酰辅酶A的乙酰基转移到组蛋白N-末端特定的赖氨酸残基上，HDAC可使组蛋白去乙酰化，与带负电荷的DNA紧密结合，使染色质致密卷曲，基因的转录受到抑制[24]。研究发现，H3K27乙酰化可以激活lncRNA TINCR[25]、lncRNA CCAT1[26]、lncRNA CRNDE[27]启动子活性，说明组蛋白乙酰化能调控lncRNA的表达。本研究结果显示，组蛋白乙酰化确实可以激活lncRNA-BMP4的表达，而转录因子STAT1也能促进lncRNA-BMP4的表达。研究发现，STAT1与DNA结合导致组蛋白乙酰化(H3ac，H4ac)[28]，STAT1也可以通过招募CBP/p300来增加组蛋白乙酰化[29]。表明STAT1的调节过程存在组蛋白乙酰化参与[30]，而在lncRNA启动子区是何种调控模式，仍有待于后续深入研究。

4 结 论

鸡lncRNA-BMP4的核心启动区域为―832～―651 bp，其中转录因子STAT1通过顺反式调控lncRNA-BMP4的启动活性；DNA甲基化不影响lncRNA-BMP4的转录，而组蛋白乙酰化可激活其表达。