陈兆芳，曹晓兰，余文静，杜 涓，武有聪*

（1.大理大学基础医学院，云南大理 671000；2.大理护理职业学院基础医学部，云南大理 671000）

我国饲养乳畜、制作食用乳和乳制品的历史非常悠久。酥油作为中国藏区传统乳制品之一，颇受游牧民族的青睐〔1〕。酥油是从牛奶、羊奶中提炼出来类似黄油的以脂肪为主要成分的乳制品，维生素和微量元素含量高，常用于营养补充、皮肤护理、肠胃调理等〔2-3〕。酥油制作方法简单，但制作程序多，制作过程中易被微生物污染。提取的酥油平均含水量约为10%，高水分与高不饱和脂肪酸使酥油在储存和运输过程中易腐败变质，保存期不宜超过半年〔4-5〕。酥油丰富的营养物质和较高的水分含量为微生物的滋生与繁殖创造了非常适宜的环境条件。有研究〔6-7〕表明酥油中含62种细菌和18种真菌，常见的病原菌有金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、沙门菌和志贺菌等。酥油中微生物的种类和数量直接影响酥油的品质和食用安全〔8〕。目前有关云南少数民族地区酥油中微生物种类及常见病原菌的研究较少。云南西北部少数民族主要以藏族、纳西族、白族和彝族为主，各少数民族为适应滇西北高海拔的自然环境，创造了各具特色的生产、生活方式和风俗习惯。酥油作为云南高海拔地区少数民族的特有食品，在高寒山区少数民族生活中尤为重要。本项目基于酥油易污染变质，难于长期保存的实际情况，从菌落计数和分离培养两方面探索云南少数民族农户自制酥油中的细菌总数和常见病原菌种类，为少数民族地区酥油的安全食用提供参考。

1 材料与方法

1.1 培养基的制备 平板计数琼脂培养基（PCA）23.5g，加去离子水1 000 mL，121℃灭菌20 min，分装于无菌平皿（20 mL/皿），冷却备用。孟加拉红琼脂36.6 g，加热溶解于1 000 mL去离子水中，121℃灭菌20 min，分装备用。沙氏葡萄糖琼脂培养基（SDA）：称取蛋白胨10.0 g，琼脂粉20.0 g，葡萄糖40.0g，加去离子水定容至1 000 mL，115℃灭菌20 min，置于60℃水浴箱恒温，加抗生素（青霉素100 μg/mL，氯霉素10 μg/mL）后混匀，分装备用。结晶紫中性红胆盐琼脂（VRBA）41.5 g，加热溶解于1 000 mL蒸馏水中，煮沸后置于45℃水浴箱备用（用时配制）。Baird-Parker琼脂50.1 g，溶解于1 000 mL去离子水，121℃灭菌20 min，分装备用。麦康凯培养基50.0 g，加热溶解于1 000 mL去离子水中，121℃灭菌20 min，分装备用。上述培养基均购自北京路桥技术有限公司。

1.2 酥油样品采集 于2017年10—12月先后2次采集云南省丽江市某乡高海拔地区农户传统手工自制酥油样品35份。固体食品样品采用“三层五点”的采样原则〔9〕，用无菌刀具在每份酥油样品的5个部位取样。样品放入无菌袋中置于冰盒保存，及时送检。

1.3 菌落总数测定 称取样品（25 g/份）放入无菌均质袋中，加入225 mL 0.9%氯化钠水溶液（1∶10），37℃振荡溶解，制成酥油原液，经10倍系列稀释（1∶100、1∶1 000、1∶10 000、1∶100 000）后取1 mL样品涂布于PCA，每个浓度梯度涂布3个平皿，37℃培养24 h计数。28℃培养5 d，用孟加拉红琼脂平板对霉菌/酵母菌总数计数。菌落总数30~300 CFU为有效范围。

1.4 霉菌/酵母菌鉴定 酥油原液采用分区划线法接种于含抗生素的SDA，28℃培养3~5 d观察结果。通过菌落特征及形态染色鉴定。肉眼见丝状型菌落，镜下有菌丝者鉴定为霉菌；呈酵母型或类酵母型菌落，仅有孢子相者鉴定为酵母菌。

1.5 常见致病菌的分离鉴定 酥油原液接种于VRBA平板鉴定大肠埃希菌〔10〕，接种于Baird-Parker平板鉴定金黄色葡萄球菌〔11〕，接种于麦康凯培养基鉴定肠道致病菌。样品接种后37℃培养24 h观察结果，疑似致病菌结合菌落形态、染色特性、生化反应及血清学试验综合鉴定。

1.6 统计分析 实验数据采用GraPhpad Prism 8.0统计分析，酥油中的菌落总数以（±s）表示，并取自然对数值进行分析。

2 结果

2.1 菌落总数检测结果35份酥油样品涂布于PCA，检出细菌的样品数35份，检出率100.0%；酥油样品中细菌菌落总数的lgCFU为（4.08~5.31）/g，细菌lgCFU平均值为（4.97±4.81）/g，酥油样品细菌菌落总数超标（CFU>3×104/g）26份，超标率74.3%。35份酥油样品涂布于孟加拉红平板进行CFU计数，检出霉菌/酵母菌31份，检出率88.6%；霉菌/酵母菌菌落总数lgCFU为（2.00~4.98）/g，lgCFU均值为（4.31±4.42）/g，检出真菌的31份标本霉菌/酵母菌总数均超过标准。见表1。

表1 云南某地区农户自制酥油样品微生物检测结果（x±s）

2.2真菌检测结果35份酥油样品采用分区划线法接种于含抗生素的SDA，检出真菌阳性标本28份，检出率80.0%，其中，同时含有霉菌及酵母菌的样本9份，仅含酵母菌的样本19份。

2.3 食源性致病菌的检测与鉴定结果35份酥油样品接种于麦康凯培养基中，检出阳性样品（乳糖不发酵无色菌落，G-菌）4份，疑似肠道致病菌检出率为11.4%（4/35）。4株疑似肠道致病菌通过生化反应进一步鉴定，3株菌（SY-5、SY-8和SY-9）在KIA培养基上的结果为：乳糖（-）、葡萄糖（+）、气体（-）、H2S（-），在MIU培养基上的结果为：动力（-）、吲哚（-）、尿素（-），鉴定为志贺菌（Shigella）；1株菌（SY-7）在上述2种培养基上的结果分别为：乳糖（-）、葡萄糖（+）、气体（+）、H2S（-），动力（+）、吲哚（-）、尿素（+），鉴定为普通变形杆菌（Proteus vulgaris）。35份酥油样品中均未检出大肠埃希菌和金黄色葡萄球菌。见表1。

3 讨论

酥油是从牛奶、羊奶中提炼出的脂肪，富含多种维生素，滋润胃肠，和脾温中，常用做酥油茶、酥油糌粑、糕点配料等，具有较高的营养价值〔12〕。此外，酥油还具有食疗及保健功效，常用于游牧民族儿童润肤、皮肤外伤、便秘、新生儿硬肿症、压疮等护理治理，素有“奶中黄金”之称，尤其以牦牛乳加工的藏式酥油最受欢迎〔13-16〕。酥油与高海拔地区少数民族的生活息息相关，其制作方法简单，多以家庭式及小作坊式制作为主，标准化生产的酥油只占市场份额的30%左右，这种生产方式决定了其在制作过程中极易被病原微生物污染〔17-18〕。

目前，我国尚无针对酥油的食品微生物学检测方法及各项微生物指标的相关规定。本实验采用国家标准GB 4789.15—2016进行霉菌/酵母菌计数〔19〕，并参照王秋玲〔20〕报道的西藏地方卫生微生物标准要求，酥油中细菌总数应不高于3.0×104CFU/g（lgCFU≤4.48/g），霉菌/酵母菌总数不高于50 CFU/g（lgCFU≤1.70/g），致病菌如金黄色葡萄球菌、志贺菌、沙门菌等不得检出。本实验采集的云南某地区少数民族家庭自制酥油35份，细菌和霉菌/酵母菌检出率分别为100.0%和88.6%，35份酥油样品中细菌菌落总数lgCFU均值为（4.97±4.81）/g，细菌菌落总数超标率为74.3%，霉菌/酵母菌菌落总数lgCFU均值为（4.31±4.42）/g，霉菌/酵母菌菌落总数超标率为88.6%。此外，分离培养初步鉴定出3株志贺菌和1株普通变形杆菌。采用本实验室保存的2种痢疾志贺菌诊断血清（血清型别不详）进行玻片凝集反应，进一步确定分离病原菌的血清型，结果未见明显凝集，提示这3株志贺菌并非这2种血清型。35份酥油样品中未分离到金黄色葡萄球菌和大肠埃希菌。上述结果提示，本地区家庭自制酥油的卫生微生物安全令人担忧，回顾采样地点推测，可能与农户家庭条件差，环境潮湿，无冰箱储存酥油，个人卫生习惯差等因素有关。达娃卓玛〔21〕对西藏各地220份酥油进行微生物检测，发现酥油样品中细菌菌落总数lgCFU均值为（3.71±1.13）/g，霉菌/酵母菌菌落总数lgCFU均值为（3.97±1.33）/g，220份样品中均分离到金黄色葡萄球菌（检出率100.0%），本实验中酥油的细菌菌落总数及霉菌/酵母菌菌落总数比达娃卓玛的结果偏高，但未检出金黄色葡萄球菌，检出3株志贺菌，并且酥油样品菌落计数的标准差较大，这可能与酥油的自动化、标准化制作比例低有关，小作坊、一家一户式的制作方式和习惯，制作环境和个人因素对酥油产品质量的影响较大。

有研究〔22〕表明，微生物的种类和数量直接影响酥油产品的风味、品质和安全性。酥油样品中优势细菌种群主要为乳球菌、假单胞菌、链球菌和乳杆菌，优势真菌主要为酵母菌（约50%为假丝酵母），霉菌易引起酸败及产生毒素，影响酥油的食品安全。本实验通过孟加拉红平板CFU计数检出真菌阳性酥油样品31份（检出率88.6%）；通过分区划线接种于SDA检出真菌阳性样品28份（检出率80.0%），检出结果的差别可能是由于CFU计数和分区划线2种检测方法的样本接种量不同引起。SDA检出的28份样品中有9份被霉菌污染，应警惕食用酥油引起的真菌感染或中毒。本实验未对酥油中酵母菌的种类及数量进行鉴定，采集的样品数量亦有限，尚不能准确反映该地区酥油中益生菌的卫生指标。

综上所述，该地区酥油食品存在安全隐患，相关卫生部门应加强牦牛及其乳制品的卫生监管，制定酥油的食品卫生微生物学国家标准，提倡挤奶前清洁牦牛乳房，牛奶进行巴氏消毒，注意个人卫生，保持环境清洁，消毒器皿，低温或冷冻储存，取缔卫生不达标的小作坊，加快推进酥油制作的程序化、标准化、机械化，以促进少数民族地区乳制品的健康发展。