孙 伟，袁会珠，陈淑宁

（中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193）

油茶是我国特有的油料植物树种，主要分布于我国长江流域以南地区，是我国部分地区重要的经济作物。油茶收获期产生大量茶油，还能产生茶枯、茶壳等副产品，是医疗、化学等领域的重要原料，综合使用价值极高[1,2]。近年来，随着国家优惠政策的出台，油茶种植规模快速增加。

油茶炭疽病是我国油茶种植区最常见的病害之一，在我国油茶主要产区特别是在湖南、江西和广西等省（区）发生普遍，引起严重落果、落蕾、枝梢枯死，甚至整株衰亡。各省（区）每年因油茶炭疽病造成油茶籽实减产 10%～30%，重病区减产 40%～50%，造成重大的经济损失[3]。随着油茶炭疽病病原研究的不断深入，已报道多种刺盘孢属真菌可以侵染油茶，包括山茶刺盘孢Colletotrichum camelliae、果生刺盘孢Colletotrichum fructicola、暹罗刺盘孢Colletotrichum siamense、隐秘刺盘孢Colletotrichum aenigma、胶孢刺盘孢Colletotrichum gloeosporioides、哈锐刺盘孢Colletotrichum horii、卡瓦刺盘孢Colletotrichum kahawae、喀斯特刺盘孢Colletotrichum karstii和博宁刺盘孢Colletotrichum boninense[4-9]。

目前，喷施化学杀菌剂依旧是防治炭疽病的主要措施，生产上常使用甾醇脱甲基化酶抑制剂类，甲氧基丙烯酸酯类，苯并咪唑类等药剂进行炭疽病防控[10]。研究表明，不同种刺盘孢对同种杀菌剂的敏感性存在差异。我国东部地区草莓炭疽病菌中，果生刺盘孢对戊唑醇的敏感性明显高于暹罗刺盘孢[11]。海南地区橡胶树病菌中，胶孢复合群（Gloeosporioides complex）对多菌灵的敏感性明显高于尖孢复合群（Acutatum complex）[12]。此外，平头刺盘孢Colletotrichum truncatum对大部分甾醇脱甲基化酶抑制剂类药剂存在天然抗性[13]。因此，明确油茶炭疽病菌的种群结构，并据此筛选化学防治药剂，对油茶炭疽病的精准绿色防控具有重要意义。

我国目前尚无登记于油茶炭疽病的防治药剂，生产上主要采用多菌灵、甲基托布津等苯并咪唑类杀菌剂进行防治[14,15]，但李河等[16]调查发现该类药剂抗性产生严重，部分地区已不再适合于油茶炭疽病的防治，亟需筛选高效安全的防治药剂。

本研究对采自不同地区的油茶炭疽病病叶进行病原菌分离鉴定，并选择不同作用机制的杀菌剂对分离的病原菌进行室内毒力测定，明确不同地区、不同种群的油茶刺盘孢对药剂的敏感性，并对科学用药提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 供试材料

1.1.1 病叶采集 从河北、浙江、江西、湖南、云南和贵州油茶主产区采集具有典型发病症状的油茶炭疽病病叶（表1）。

表1 供试菌株的种类名称及采集地点Table 1 Colletotrichum isolates used in this study

1.1.2 供试药剂 供试的 13种杀菌剂原药分别为多菌灵、吡唑醚菌酯、嘧菌酯、苯醚甲环唑、戊唑醇、氟环唑、咪鲜胺、苯并烯氟菌唑、啶酰菌胺、氟醚菌酰胺、氟吡菌酰胺、氟啶胺、咯菌腈。药剂生产厂家，作用类别，有效成分含量，毒力测试浓度见表2。

表2 供试药剂类别、有效成分含量、生产厂家及其设定浓度Table 2 Fungicide classes, name, content of active ingredients, fungicide concentrations for sensitivity assays

1.2 方法

1.2.1 病原菌分离 采用组织分离法分离病原菌[17]。在油茶叶片病健交界处剪取5 mm×5 mm病块组织，先用无菌水冲洗30 s，再用75%的酒精表面消毒40 s，最后用无菌水冲洗3次，每次30 s。将消毒后的病块组织置于PDA培养基上，26 ℃恒温培养。3 d后，用无菌针挑取病块组织边缘少许菌丝，连续纯化2～3次。纯化菌株保存于 PDA斜面上，于4 ℃保存备用。

1.2.2 病原菌分子鉴定 选用植物基因组DNA提取试剂盒（擎科生物，北京）提取病原菌DNA。PCR扩增目的片段包括核糖体转录间隔区序列（internal transcribed spaces，ITS）、肌动蛋白基因（actin gene，ACT）、几丁质合成酶A基因（chitin synthase A gene，CHS-1）、钙调蛋白基因（calmodulin，CAL）、β-微管蛋白基因（β-tubulin gene，TUB2）和3-磷酸甘油醛脱氢酶基因（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase gene,GAPDH），引物序列委托擎科生物工程公司合成（表3）。PCR反应体系总体积为25 μL，包括1 μL DNA模板，1 μL 上游引物，1 μL 下游引物，12.5 μL 2×MasterMix，9.5 μL ddH2O。PCR 反应程序：96 ℃预变性2 min；94 ℃变性20 s，退火（ITS退火温度54 ℃；ACT退火温度 58 ℃；CAL退火温度59 ℃；CHS-1退火温度56 ℃；TUB2退火温度59 ℃；GAPDH退火温度56 ℃）20 s，72 ℃延伸30 s，40个循环。吸取4 μL PCR产物在1%琼脂糖凝胶电泳检测，将检测到清晰目的条带的PCR产物送至擎科生物科技公司进行测序，将测序结果在GenBank数据库进行BLASTN同源性分析，并选定模式菌株作为参考序列用于聚类分析。MEGA 7.0 软件以最大似然法（Maximum Likelihood）构建多基因系统发育树。

表3 选择的基因位点及其相应引物序列Table 3 Primers used for PCR amplification and sequencing in this study

1.2.3 病原菌形态学观察 用直径5 mm的打孔器从预先活化好的菌株边缘打取菌块，每株3次重复，在PDA平板上25 ℃黑暗培养7 d，观察并记录菌落形态特征。培养产生分生孢子后，镜检记录 50个分生孢子大小及形态特征。

1.2.4 病原菌对化学杀菌剂的敏感性测定 采用菌丝生长速率法测定杀菌剂对病原菌菌丝生长的抑制作用[24]。用二甲亚砜将各试验药剂溶解为105μg/mL的母液，将母液加入冷却至50 ℃左右的PDA培养基中，配置成一系列浓度的含药培养基，混匀后倒入9 cm培养皿中，获得含药培养基平板。每种药剂设置5个浓度梯度，以无菌水做对照。用直径为5 mm打孔器在培养5 d的菌落边缘打取菌饼，将菌饼接种于含药培养基平板中央，每皿接1个菌饼，每个浓度3个重复。25 ℃黑暗培养5 d后采用十字交叉法测量菌落直径，计算出菌丝生长抑制率。取药剂浓度的对数值为X，菌丝生长相对抑制率的机率值为Y，用DPS软件（V 3.01）求毒力回归方程及EC50。按以下公式计算抑制率。抑制率（%）=（对照菌落直径—处理菌落直径）/对照菌落直径×100。

2 结果与分析

2.1 病原菌分离

采样地区涉及河北、浙江、江西、湖南、云南和贵州6个省油茶主产区，共分离17株油茶炭疽病菌。

2.2 病原菌分子鉴定

将测试菌株的目的片段序列在NCBI网站进行BLAST同源性搜索分析，确定这些供试菌株基因序列与已知的29个胶孢复合群参考菌株近似。然后，将这29个菌株作为参照菌株并从GenBank数据库中下载其相关序列用于聚类分析。以 GenBank相关权威菌株序列为参照，以博宁刺盘孢Colletotrichum boninenseCBS 123755作为外群，用 ITS、TUB2、ACT、CAL、GAPDH、CHS-1基因的联合序列采用ML法构建系统发育树。Bootstrap 值大于50%，1000 次重复。从系统发育树中可以看出，17株油茶炭疽病菌均属于胶孢复合群，与6个已知刺盘孢属物种聚为不同群，且具有较高的支持率（图1）。它们分别归属为山茶刺盘孢、果生刺盘孢、暹罗刺盘孢、胶孢刺盘孢、卡瓦刺盘孢和哈锐刺盘孢。

图1 油茶炭疽病菌菌株多基因序列采用最大似然法构建系统发育树Fig. 1 Phylogenetic tree of Colletotrichum isolates from tea-oil tree using multi-locus sequences by Maximum Likelihood method

2.3 病原菌形态学鉴定

根据分子系统发育树分析，结合菌落形态和分生孢子形态等特征，也支持 17株油茶炭疽病菌分别归属山茶刺盘孢、果生刺盘孢、暹罗刺盘孢、胶孢刺盘孢、卡瓦刺盘孢和哈锐刺盘孢，其代表菌株特征描述如下（图2）：

图2 在PDA平板上培养7 d后菌落形态及分生孢子特征Fig. 2 Front and back view of 7-day-old PDA culture and morphological characteristics of conidia

山茶刺盘孢菌株jxnc14：采集于江西省。菌落正面初期为灰白色，后期变为橄榄绿色；背面由黄绿色变为深绿色。气生菌丝发达，菌落绵密，呈毛毡状。培养两周后菌落表面会产生橘红色孢子堆，分生孢子圆柱形或梭形，两端钝圆，大小为（10.5～23.5）µm×（4.1～8.1）µm，与Dicken和Cook[25]对山茶刺盘孢形态描述相一致。

果生刺盘孢菌株mc173：采集于河北省。菌落初期为白色，后期变为灰色；背面中心灰色至深灰色，边缘颜色稍浅。菌落表面有浅灰色气生菌丝，由稀疏至茂密。培养两周后，会产生橘红色孢子堆，分生孢子圆柱形或椭圆形，两边钝圆或稍尖，大小为（10.0～17.8）µm×（3.9～6.6）µm，与Prihastuti等[26]对果生刺盘孢形态描述相一致。

暹罗刺盘孢菌株gxnn23：采集于湖南省。菌落初期为白色，后期变为浅褐色；背面淡黄色至黑褐色。菌落棉絮状，气生菌丝发达，菌落绵密。产孢较少，分生孢子圆柱形，两端钝圆，大小为（10.0～16.3）µm×（3.4～6.3）µm，与Prihastuti等[26]对暹罗刺盘孢形态描述相一致。

胶孢刺盘孢菌株cg：采集于湖南省。菌落初期为白色，后期变为深灰色；菌落背面浅灰色至深灰色。菌落表面生有白色稀疏的气生菌丝。培养两周后菌落表面会产生橘红色孢子堆，分生孢子圆柱形，两端钝圆或稍平，大小为（10.8～16.8）µm×（3.8～6.2）µm，与Prihastuti等[26]和Cannon等[27]对胶孢刺盘孢形态描述相一致。

卡瓦刺盘孢菌株c2：采集于贵州省。菌落初期为灰白色后期为深灰色：背面由灰白色变为深灰色，中心散步深灰色辐射状色素。菌落表面气生菌丝浓密。培养两周后菌落表面会产生橘红色孢子堆，分生孢子圆柱形，两端钝圆，与Waller等[28]对卡瓦刺盘孢的描述一致。

哈锐刺盘孢菌株ch：采集于湖南省。菌落正面初期为白色，后期为浅褐色；背面由白色变为浅褐色，并产生同心轮纹。菌落表面气生菌丝较薄，棉花状。产孢较少，分生孢子椭圆形或圆柱形，两端钝圆，大小为（6.1～15.0）µm×（3.2～7.0）µm，与Wei和Johnston[29]及Xie[30]对哈锐刺盘孢描述一致。

2.4 油茶炭疽病菌对杀菌剂的敏感性测定

本研究选取了13种药剂，通过菌丝生长速率法，测定了其对17株油茶炭疽病菌的室内毒力活性。其中，嘧菌酯、啶酰菌胺、氟醚菌酰胺、氟吡菌酰胺4种药剂对油茶炭疽病菌的EC50值大于100 μg/mL，抑菌活性较弱，未录入表中（表4）。从图3中可以看出，不同杀菌剂对油茶炭疽病菌菌丝生长抑制作用明显不同。

表4 油茶炭疽病菌对杀菌剂敏感性测定Table 4 Fungicides sensitivity of Colletotrichum isolates from tea-oil tree

图3 油茶炭疽病菌对九种杀菌剂的敏感性测定Fig. 3 Sensitivity of Colletotrichum spp. to nine fungicides tested

4种DMI类药剂对油茶炭疽病菌都有较好的抑制作用。其中，咪鲜胺对油茶炭疽病菌的毒力最强，平均 EC50仅为 0.035 μg/mL。其次为苯醚甲环唑、氟环唑、戊唑醇，平均 EC50依次为 0.342 μg/mL、0.490 μg/mL、1.401 μg/mL。

4种SDHI类药剂对油茶炭疽病菌的抑制作用存在差异。油茶炭疽病菌对啶酰菌胺、氟醚菌酰胺、氟吡菌酰胺表现为不敏感，所有菌株的EC50值均大于100 μg/mL；仅对苯并烯氟菌唑表现敏感，平均EC50为 0.534 μg/mL。

两种QoI类杀菌剂嘧菌酯和吡唑醚菌酯对油茶炭疽病菌的抑制效果也存在差异。其中，吡唑醚菌酯对油茶炭疽病菌的抑菌活性高，平均EC50为0.243 μg/mL；而从菌丝生长抑制情况来看，嘧菌酯对油茶炭疽病菌的抑菌活性较低，所有菌株的EC50值均大于100 μg/mL。

多菌灵，氟啶胺，咯菌清对油茶炭疽病菌菌丝生长都有较好的抑制作用。其中，油茶炭疽病菌对氟啶胺最敏感，平均EC50为0.076 μg/mL；多菌灵和咯菌腈也具有较高抑菌活性，平均EC50分别为0.169 μg/mL和 0.202 μg/mL。

此外，除戊唑醇和苯并烯氟菌唑以外，不同油茶炭疽病菌菌株间对同一杀菌剂的 EC50值分布范围较小（图3）。其中，戊唑醇对油茶炭疽病菌的EC50范围为0.317～2.655 μg/mL，最高值和最低值相差2.338 μg/mL；苯并烯氟菌唑对油茶炭疽病菌的EC50范围为0.027～2.149 μg/mL，最高值和最低值相差2.122 μg/mL。 而其他药剂对不同油茶炭疽病菌的 EC50值分布范围较小，以咪鲜胺为例，EC50最大值与最小值之间相差仅为 0.059 μg/mL。

3 讨论

刺盘孢属真菌是最常见的植物病原菌之一，其寄主广且分类复杂[31]。不同种刺盘孢的致病机理及对药剂的敏感性都存在差异[4,11,12,32]。因此，明确油茶炭疽病病原菌，确定其优势种群，将有助于制定更加高效合理的防治措施。本文从我国河北、浙江、江西、湖南、云南、贵州主要油茶产区，共分离出了山茶刺盘孢、果生刺盘孢、暹罗刺盘孢、胶孢刺盘孢、卡瓦刺盘孢、哈锐刺盘孢6个种，均属于胶胞炭疽复合群。Wang等[4]和Jiang等[6]也报道造成我国油茶炭疽病的主要病原菌为胶孢复合群。

目前，化学防治是炭疽病最有效的防控措施。然而，我国尚无登记于油茶炭疽病的防控药剂。因此，我们从国内外登记或报道可用于炭疽病防治的药剂中选取了13种，涵盖了6种作用机理。其中，DMI类是目前炭疽病防控中最常用的药剂。Cao等[12]研究表明咪鲜胺、苯醚甲环唑、丙环唑3种DMI类药剂对胶孢复合群均有较好的防效，其中咪鲜胺的 EC50值最低，与本文的研究结果相吻合。此外，不同种的刺盘孢对不同的DMI类药剂敏感性存在显著差异。Chen等[13]研究表明，在桃炭疽病菌中，属于胶胞复合群的暹罗刺盘孢和果生刺盘孢对苯醚甲环唑、丙环唑、戊唑醇、叶菌唑、粉唑醇和腈苯唑 6种DMI类杀菌剂均敏感，而睡莲刺盘孢Colletotrichum nymphaeae和平头刺盘孢则对部分测试DMI药剂表现出天然抗性。油茶炭疽病菌的优势种均属于胶胞复合群，因此，结合本研究和前人报道，DMI药剂可作为其推荐用药。

QoI类杀菌剂一直被广泛用于炭疽病的防治。本研究选取了嘧菌酯和吡唑醚菌酯两种药剂，通过菌丝生长速率法，发现嘧菌酯对油茶炭疽病菌的抑菌活性较低（EC50＞100 μg/mL），但同属QoI药剂的吡唑醚菌酯抑菌活性较高，因此，还需要通过孢子萌发法等试验进一步验证测试菌株是否对嘧菌酯产生了抗性，也需采集更多菌株验证嘧菌酯是否能有效防治油茶炭疽病。此外，QoI类药剂也极易产生抗药性，有关其菌株已经在我国草莓和桃树上被相继报道[11,33,34]。因此，在使用QoI类药剂防控油茶炭疽病时，需要注意轮换用药，并监测炭疽病菌的抗药性产生情况。

MBC类药剂多菌灵在过去很长一段时间一直是防治炭疽病的首选药剂。在本研究中，多菌灵也对油茶炭疽病菌有很好的抑菌效果。但李河等[16]研究指出湖南、江西、广东、海南四地油茶苗圃中的炭疽病菌已对多菌灵产生严重的抗药性。因此，在油茶炭疽病防治时应控制多菌灵等MBC类杀菌剂的使用频率，以延缓油茶炭疽病菌对此类杀菌剂产生抗药性。

SDHI类药剂是一类拥有优异杀菌活性和宽广杀菌谱的新型杀菌剂。然而，Ishii[35]研究发现胶孢刺盘孢，尖孢刺盘孢，谷物刺盘孢Colletotrichum cereale和西瓜刺盘孢Colletotrichum orbiculare对啶酰菌胺，氟吡菌酰胺和氟唑菌酰胺等SDHI类杀菌剂表现出天然抗性，但对苯并烯氟菌唑表现为敏感。本文的研究也进一步证实了这一结果，啶酰菌胺、氟醚菌酰胺、氟吡菌酰胺对油茶炭疽病菌的抑菌活性较低（EC50＞100 μg/mL），而苯并烯氟菌唑对油茶炭疽病菌表现出优异的抑菌活性（EC50=0.534 μg/mL）。苯并烯氟菌唑是由先正达研制的一种新型的SDHI类杀菌剂。目前已经在美国已被登记用于苹果炭疽病的防治，并且它对草莓炭疽病也有很好的防效[36,37]。有关苯并烯氟菌唑对油茶炭疽病的田间药效还需进一步研究。

除了以上药剂以外，咯菌腈和氟啶胺对油茶炭疽病菌也有优异的抑制活性。虽然这两种药剂在国内尚未被用于炭疽病的防治，但在国外这两种药剂已经被登记用于防治草莓炭疽病[38,39]。因此，咯菌腈和氟啶胺在油茶炭疽病的防控上具有一定的应用潜力。后续将进一步通过田间药效试验验证上述药剂的防治效果。