袁梦蕾，范乐乐，赵 雪，钟增明，孙漫红*，李世东*

（1. 中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193；2. 北京启高生物科技有限公司，北京 100193）

根结线虫Meloidogynespp.是农业生产中的重要病害，每年造成的损失高达1000亿美元[1]。在我国，根结线虫在各地蔬菜产区都普遍发生，尤其是设施蔬菜生产中，由于高密度单一种植、水肥强度增加，病害日趋严重，严重制约了产业健康发展。目前主要采用化学杀线虫剂或土壤熏蒸等措施控制根结线虫病，但大多都存在抗药性问题，并对生态环境具有一定危害。近年来，环境友好型生物杀线虫剂的研发和应用受到越来越多的关注，目前应用较多的主要有淡紫紫孢菌Purpureocillium lilacinum、厚垣普奇尼亚菌Pochonia chlamydosporia等[2,3]。

淡紫紫孢菌P. lilacinum（异名：淡紫拟青霉Paecilomyces lilacinus）是一种重要的食线虫真菌，分布广泛，寄主范围广，可寄生植物线虫的卵、雌虫和胞囊[4,5]，对根结线虫、胞囊线虫Heteroderaspp.等多种植物寄生线虫均具有良好的防治效果[6-8]，其代谢产物还能够促进植物的生长[9,10]。目前，淡紫紫孢菌制剂已被广泛用于不同作物线虫病害的防控[11-13]。据统计，截至2022年5月我国批准登记的淡紫紫孢菌生物农药产品有 12个，剂型主要为颗粒剂和粉剂。这些菌剂中活性成分为分生孢子和菌丝，对不良环境抵抗能力较差，因而在贮存和田间应用过程中很容易导致活性丧失，影响其生防效果和稳定性[14]。

淡紫紫孢菌在特定条件下可以形成抗逆繁殖体—微菌核（Microsclerotia，MS），从而大幅提高生防菌的贮存活性[15]。微菌核由大量菌丝缠绕特化而成，是丝状真菌度过不良环境的一种休眠结构[16,17]。2008年，Jackson和Jaronski[17]首次报道虫生真菌金龟子绿僵菌Metarhizium anisopliae可以在液体培养基中产生微菌核，此后，接连观察到球孢白僵菌Beauveria bassiana、布氏白僵菌B. brongniartii和哈茨木霉Trichoderma harzianum等生防真菌均可在一定条件下产生微菌核[18,19]。进一步研究发现，微菌核可以显著提高生防菌耐干燥、耐高温能力，延长储存期。如白僵菌微菌核制剂，4 ℃下储存6个月仍可全部萌发，20 ℃储存6个月萌发率为68%[20]。莱氏野村菌Nomuraea rileyi微菌核在干燥条件下可储存半年以上，室温条件下储存一年仍具有较高的活性[21-23]。

淡紫紫孢菌YES-2-14菌株是本实验室分离到的一株生防菌，对根结线虫病具有较好的防治效果[24,25]。前期研究发现，该菌在特定条件下可以形成微菌核，并具有较好的耐热性和稳定性。本研究通过室内生测和温室盆栽试验，研究淡紫紫孢菌微菌核对根结线虫的寄生作用和防病效果，以及不同土壤条件对生防菌定殖的影响，为淡紫紫孢菌微菌核制剂的研发和田间应用提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

供试菌株：淡紫紫孢菌 YES-2-14菌株分离自云南烟草根结线虫，由中国农业科学院植物保护研究所土传病害实验室分离、鉴定、保存。

培养基：蔗糖 40 g，豆粕粉 12 g，KH2PO44 g，MgSO40.6 g，CaCl20.8 g，FeSO4·7H2O 0.1 g，ZnSO4·7H2O 15 mg，MnSO415 mg，蒸馏水1 L，调节pH 5.5。121 ℃灭菌25 min。

黄瓜：中农6号，购于北京市海淀区中蔬种业公司。

1.2 淡紫紫孢菌微菌核的制备

将淡紫紫孢菌YES-2-14接种于液体培养基中，28 ℃、180 r/min摇床振荡培养5 d，培养微菌核。将发酵液依次通过30目（孔径550 μm）、100目（孔径150 μm）灭菌的筛网，无菌水冲洗3次去除残留的培养基。收集100目筛网上的微菌核，4 ℃保存备用。

1.3 根结线虫卵的制备

从河北廊坊试验基地根结线虫发病严重的地块采集黄瓜病株，自来水冲掉土块，用解剖针挑取卵囊，放入0.5% NaClO溶液中，玻璃棒搅拌3 min。将线虫悬液依次通过灭菌的200目（孔径75 μm）和500目（孔径25 μm）筛网，无菌水反复冲洗，收集500目筛网上的线虫卵，转入50 mL离心管。调整卵悬液浓度至1000个/mL，4 ℃保存备用。

1.4 淡紫紫孢菌微菌核对根结线虫卵的寄生作用

1.4.1 接种量对卵寄生作用的影响 制备10、100、300、900 MS/mL的微菌核悬浮液。24孔组织培养板中分别加入1 mL微菌核悬液和200 μL（约200粒）线虫卵悬液，混合均匀，22 ℃培养7 d。倒置显微镜（CK2，Olympus，日本）下测定微菌核对根结线虫卵的寄生情况，计算寄生率及卵的孵化率。以无菌水为对照，每个处理3个重复。

1.4.2 提前接入微菌核对卵寄生作用的影响 培养板中加入1 mL 300 MS/mL的微菌核悬液，然后分别于0、3和7 d时加入线虫卵悬液，依照上述方法测定寄生率和卵孵化率。每个处理3个重复。

1.5 淡紫紫孢菌微菌核制剂防治黄瓜根结线虫病

1.5.1 微菌核制剂的制备 将微菌核发酵液浓度调至400个/mL，按1:1（m/m）加入硅藻土吸附，混合、阴干，过40目筛，制备微菌核制剂，含量为400 MS/g。

1.5.2 病土的制备 采集廊坊试验基地健康农田土壤，风干，过2目筛，121 ℃灭菌30 min。灭菌土中加入根结线虫卵悬液，充分混合，使土壤中卵含量为300个/100 g土，装入塑料花盆（7 cm×7 cm×7 cm）中，150 g/盆。

1.5.3 微菌核制剂防治黄瓜根结线虫病的效果 将黄瓜种子用2%的NaClO表面消毒5 min，无菌水冲洗3次，28 ℃催芽至露白，播种至育苗盘（54 cm×28 cm，5×10孔）中。待长出2～3片真叶后，移栽至病土中，每盆1株。同时，穴施微菌核制剂，接种量分别为30、150、300、1500和3000 MS/100 g土。另外，菌剂采用2次接种，其中育苗基质中微菌核用量为300 MS/100 g土，移栽时接种量分别为300和3000 MS/100 g土，测定提前接种微菌核对根结线虫病的防治效果。移栽30 d后，测量根结数及株高、根长和地上部鲜重等生长指标，计算防病效果。以不施用微菌核制剂的处理为对照。每个处理15株苗，3个重复，随机排列。温室温度控制在22 ℃～28 ℃，按照常规方式管理。

1.6 环境因子对淡紫紫孢菌定殖的影响

1.6.1 土壤温度的影响 培养皿中称取20.0 g灭菌土，加入1 mL微菌核悬液（400个/mL）和2 mL无菌水，充分混合，封口膜密封，然后分别置于10 ℃、20 ℃、30 ℃培养箱中，在0、3、6、10、15、20 d时测定土壤中淡紫紫孢菌数量。测定方法为称取1.0 g土，放入99 mL带玻璃珠的无菌水中，梯度稀释，吸取100 μL涂布于加抗PDA平板上。28 ℃培养3 d，记录菌落数量（CFU）。每个处理3个重复。

1.6.2 土壤湿度的影响 培养皿中称取20.0 g灭菌土，加入微菌核悬液和不同体积的无菌水，使土壤含水量分别为5%、10%、15%、20%和30%，混匀密封。不同时间取样测定生防菌数量。每个处理3个重复。

1.6.3 土壤pH值的影响 采用草酸和NaOH调节土壤pH，测定酸碱度对淡紫紫孢菌定殖的影响。土样风干、过筛，测定土壤pH值为7.35（中华人民共和国农业行业标准 NY/T 1377-2007）。称取200.0 g土样，分别加入6.3、12.6、25.2 g草酸和0.4、0.8、1.6 g NaOH颗粒，然后加入40 mL蒸馏水，充分混匀，室温下静置平衡7 d，测得土壤的pH值分别为4.51、5.91、6.52、7.95、8.45和9.21。将上述土样121 ℃灭菌30 min，烘干，加入微菌核悬液，依照上述方法测定淡紫紫孢菌数量。每个处理3个重复。

1.7 数据统计与分析

利用IBM SPSS Statistics 23和Excel 2019对试验数据进行分析，采用单因素ANOVA检验，Duncan新复极差法比较差异显著性（P＜0.05）。

2 结果与分析

2.1 淡紫紫孢菌微菌核对根结线虫卵的寄生作用

微菌核对根结线虫卵的寄生率随接种浓度的提高显著增加（P＜0.05）。当微菌核浓度为 300 MS/mL时，对卵的寄生率达到50.9%，继续提高接种浓度，寄生率无显著变化。同时接种微菌核和根结线虫，对线虫卵的孵化率影响不大（表1），可能在微菌核萌发侵染前，线虫卵已开始孵化。

表1 淡紫紫孢菌微菌核浓度对根结线虫卵寄生率和孵化率的影响Table 1 Effects of P. lilacinum MS concentration on parasitism rates and hatching rates of root-knot nematode

显微镜观察发现，淡紫紫孢菌微菌核萌发产生大量菌丝，继而菌丝识别线虫并开始侵染。在侵染初期，根结线虫卵内部出现大量空泡，生防菌利用线虫体内的营养生长繁殖，最终菌丝穿透卵壳，线虫卵彻底消解（图1）。

图1 淡紫紫孢菌微菌核对根结线虫卵的寄生作用Fig. 1 Parasitism of P. lilacinum MS on eggs of root-knot nematode

培养板中提前接入微菌核，可提高淡紫紫孢菌对根结线虫的寄生率，降低卵的孵化率。当微菌核萌发7 d后再与线虫卵混合培养，寄生率比同时接种提高了18.3%，卵孵化率降低了16.9%（表2），说明通过微菌核先期萌发，可有效提高生防菌的作用效果。

表2 淡紫紫孢菌微菌核接入时间对根结线虫卵寄生率和孵化率的影响Table 2 Effects of inoculation time of P. lilacinum MS on parasitism rates and hatching rates of root-knot nematode eggs

2.2 淡紫紫孢菌微菌核制剂防治黄瓜根结线虫病效果评价

温室试验表明，施用淡紫紫孢菌微菌核制剂可显著促进黄瓜生长和根系发育（P＜0.05）。当微菌核用量为150 MS/100 g土时，黄瓜株高比对照增加了46.0%，根长增加42.2%。但用量过高（超过1500 MS/100 g土）时，对黄瓜生长并没有明显的促进作用（图2）。在育苗基质中提前接入微菌核，黄瓜地上部鲜重比仅在移栽时使用菌剂增加34.2%～42.1%（表3，图3）。

图2 淡紫紫孢菌微菌核制剂使用浓度对黄瓜生长的影响Fig. 2 Effect of dosages of P. lilacinum MS agent on growth of cucumber

表3 淡紫紫孢菌微菌核制剂对黄瓜生长的影响及对根结线虫的防病作用Table 3 Effects of P. lilacinum MS agent on plant growth and control efficacy on root-knot nematode in cucumber

图3 淡紫紫孢菌微菌核制剂对黄瓜根系生长的影响Fig. 3 Effect of P. lilacinum MS agent on growth of cucumber roots

淡紫紫孢菌微菌核制剂对黄瓜根结线虫具有良好的防治作用，随着使用浓度的增加，防治效果显著提高（P＜0.05）。当微菌核添加量为300 MS/100 g土时，防效为44.7%；浓度为3000 MS/100 g土时，防效达到65.6%。育苗和移栽时两次使用微菌核制剂，可以显著提高防病效果。微菌核用量为300 MS/100 g土时，根结数量从104降为74，防效提高到60%以上（表3）。

2.3 土壤环境对淡紫紫孢菌定殖的影响

2.3.1 土壤温度对淡紫紫孢菌定殖的影响 淡紫紫孢菌微菌核施入土壤后萌发生长，并大量增殖。土壤温度对其定殖能力有显著影响（P＜0.05），20 ℃～30 ℃时，接种6 d后淡紫紫孢菌开始快速增殖，并维持在较高的水平。30 ℃下更利于淡紫紫孢菌定殖，第10 d时种群数量比低温条件（10 ℃）下提高了13.1倍（图4）。

图4 土壤温度对淡紫紫孢菌定殖的影响Fig. 4 Effect of soil temperature on colonization of P. lilacinum

2.3.2 土壤湿度对淡紫紫孢菌定殖的影响 土壤湿度对淡紫紫孢菌定殖具有显著影响（P＜0.05），水分含量过高（30%）或过低（5%）均不利于其定殖。当土壤含水量为10%～15%时，微菌核施入6 d后开始快速增殖，20 d时种群数量达到1×107CFU/g土，比低湿、高湿条件下提高6～9倍（图5）。

图5 土壤湿度对淡紫紫孢菌定殖的影响Fig. 5 Effect of soil moisture on colonization of P. lilacinum

2.3.3 土壤pH对淡紫紫孢菌定殖的影响 土壤pH值对淡紫紫孢菌定殖具有显著影响（P＜0.05）。弱酸性和中性土壤比碱性土壤更利于微菌核定殖，当pH值小于5或大于9时，生防菌种群数量增殖缓慢。微菌核施入土壤6 d后开始快速增殖，10 d后逐渐趋于稳定。当土壤pH值为6.52时，淡紫紫孢菌数量最多，10 d时菌落数量达到1.4×107CFU/g（图6）。

图6 土壤pH对淡紫紫孢菌定殖的影响Fig. 6 Effect of soil pH on colonization of P. lilacinum

3 讨论

微菌核是丝状真菌在特定条件下形成的一种抗逆结构，具有较强的耐热性、抗干燥能力，可大幅延长生防菌剂的货架期。同时，微菌核能在土壤中长期存活，菌剂可以在整个作物生长周期发挥作用，控制病虫害，并改善土壤微环境。由于其优良的特性，生防真菌微菌核制剂的研发受到广泛关注。通过改变发酵条件，一些生防真菌，如白僵菌、绿僵菌，已成功培养出微菌核，并对寄主害虫显示出较强的寄生作用[17,18,26,27]。Koppenhö fer等[27]研究发现，实验室条件下，绿僵菌微菌核制剂对草坪象甲的感染率可达到67%～80%，但温室和田间试验中对害虫的感染和控制效果并不理想。本试验中，我们发现淡紫紫孢菌微菌核制剂不仅对黄瓜根结线虫病具有良好的防治效果，同时还具有明显的促生作用，具有良好的应用前景。

应用淡紫紫孢菌微菌核制剂时，使用剂量和方法对其生防作用有很大影响。微菌核是一种休眠结构，需要通过萌发，形成大量的菌丝和孢子进而实现对线虫的侵染。低浓度下，其菌丝只能“捕捉”周围的线虫卵，但对于距离较远的线虫卵则无法进行侵染。同时，由于微菌核萌发较慢，导致线虫卵已完成孵化，难以被淡紫紫孢菌寄生。因此，实际应用中可考虑在育苗基质中提前加入微菌核，使其在植物根际定殖，从而提高对根结线虫病的防治效果。微菌核防病效果随着接种浓度的提高而增加，但浓度过高时，并不能促进植株生长，且生产成本较高。盆栽试验结果表明，当微菌核制剂用量为300 MS/100 g土，两次施用对黄瓜根结线虫病防效超过60%，并且促生作用最为明显。我们认为淡紫紫孢菌微菌核制剂田间使用浓度选用300 MS/100 g土，育苗和移栽时两次施用为宜。但在蔬菜、瓜果等易感作物生产，尤其是设施栽培中，由于连茬种植，根结线虫发病极为严重，并且夏秋季节线虫世代周期缩短，增殖迅速，因此应根据实际生产情况，在生长季增加施药次数，使土壤中生防菌种群数量长期维持在一个较高的水平，以对抗线虫的侵染。由于土壤抑菌作用普遍存在，导致生防菌剂在田间应用时效果不稳定[28-29]。有研究显示，淡紫紫孢菌分生孢子在一些耕作土壤中的萌发率低于30%[30,31]，因而严重影响了生防菌的作用。微菌核对土壤环境适应性强，易于定殖，作用稳定，作为一种新型生防制剂具有更大的应用潜力。本研究表明，淡紫紫孢菌微菌核制剂适用范围广，当土壤含水量为5%或30%，pH为4.51或9.21时，微菌核仍可萌发并大量产孢，种群数量达到106CFU/g土，从而有效克服土壤抑菌作用的影响，充分发挥其生防功能。同时发现，在弱酸性至中性土壤中，土壤湿度为10%～15%、温度20 ℃～30 ℃时更利于淡紫紫孢菌微菌核萌发、生长和增殖。生产中应根据微菌核的特性，优化水分管理，合理选用应用技术，从而达到最佳的防病效果。

目前，对生防真菌微菌核制剂的研发还限于实验室阶段。虽然通过液体培养一些生防菌可以产生微菌核，但总体水平较低，产量在104MS/mL左右[17-19]，而分生孢子发酵水平可达到108～109CFU/mL。虽然微菌核用量相对较少，但生产成本显著高于分生孢子制剂，优化微菌核培养条件，提高微菌核发酵水平是其大规模生产和应用的关键。此外，适宜的使用技术也是微菌核制剂成功推广应用的重要条件。液体发酵培养出的淡紫紫孢菌微菌核直径在200～500 μm，如直接采用液剂灌根会导致部分微菌核停留在土壤表面，影响生防效果。可将微菌核制备成微粒剂或颗粒剂，采用拌土、穴施或灌根处理，也可以结合其他生防产品或低毒化学药剂，从而有效防控土传病害。