纪林东，马 超，徐 军,2，赵宜君,2，张彦辉，段小莉，杨 洋，陈 昶,2*

（1. 河北中保绿农作物科技有限公司，北京 100193；2. 中国农业科学院植物保护研究所，北京 100193）

番茄灰霉病是由灰葡萄孢Botrytis cinerea引起的番茄病害，主要发生在花期和结果期，对花、果实、叶片和茎造成危害。番茄灰霉病的发生时间较早，持续时期也比较长，造成的损失极大[1]。发病后可造成早春大量烂果，一般减产20%～30%，严重的地块甚至高达50%左右。该病在采后的储藏运输过程中也可继续造成严重危害[1]。目前，化学药剂依然是防治番茄灰霉病的主要用药，但多年用药导致灰霉病菌对市售常用杀菌剂的抗药性不断增加。

中生菌素是由中国农业科学院原生物防治研究所研制的一种农用抗生素，是由淡紫灰链霉菌海南变种产生的一种抗生素，属N－糖苷类碱性水溶性物质[2]，可通过抑制病原细菌蛋白质肽键的合成以及抑制真菌菌丝生长和孢子萌发而发挥较好的抑菌作用，具有触杀和渗透作用。Ren等[3]明确了中生菌素对茶树叶斑病病原菌上的作用机制，表明中生菌素可诱导细胞器、隔膜和胞外多糖的形态变化，以核糖体为靶点干扰翻译，在信使 RNA和蛋白质水平上影响菌丝部分蛋白的生物合成。目前，农民开始尝试使用中生菌素防治番茄灰霉病，但对其室内毒力及作用机理尚不明确。纳他霉素是一种无臭、无味、低剂量且安全性高的食品防腐剂，是由纳他链霉菌发酵制得的一种白色至乳白色的无臭无味结晶粉末，通常以烯醇式结构存在。它的作用机理是与真菌的麦角甾醇以及其他甾醇基团结合，阻遏麦角甾醇生物合成，从而使细胞膜畸变，最终导致渗漏，引起细胞死亡[4]。该药物对灰霉病具有一定防治效果，张鹏[5]明确了其对灰葡萄孢的作用机理，主要是降低细胞膜中麦角甾醇的含量，影响细胞膜结构，造成内容物的渗漏抑制菌丝生长。

对具有不同作用机理的生物农药进行复配，有希望进一步提升生物农药的作用效果。将中生菌素和其他农药进行复配也是当前农药行业研究的热点之一[6]。本文选取阻止真菌麦角甾醇合成的纳他霉素与抑制病原菌蛋白质合成的中生菌素进行复配，通过室内毒力测定和田间试验探究二者防治番茄灰霉病菌的协同增效作用，为复配生物农药的研发提供指导。

1 材料与方法

1.1 供试菌株、药剂和培养基等

供试菌株：番茄灰霉病菌Botrytis cinerea，由沈阳农业大学植物保护学院农药课题组提供。

供试器材：显微镜，培养箱，电子天平，凹玻片，载玻片，计数器等。

供试药剂：10%中生菌素母药，福建凯立生物制品有限公司；98%纳他霉素，上海麦克林生化科技有限公司；复配制剂1：3%中生菌素·纳他霉素可湿性粉剂（简称WP），中生菌素:纳他霉素=9:1；复配制剂2：3%中生菌素·纳他霉素WP，中生菌素:纳他霉素=1:1；复配制剂3：3%中生菌素·纳他霉素WP，中生菌素:纳他霉素=7:3，3%中生菌素WP，3%纳他霉素WP，自制。

菌悬液：用去离子水冲洗在番茄灰霉病菌在PDA培养基培养产生的孢子，制取106孢子/mL菌悬液，备用。

1.2 试验方法

1.2.1 不同混和药剂对灰霉病菌的抑制作用 采用菌丝生长速率法[7]检测混和药剂对病原菌的生长作用。通过预试验确定中生菌素、纳他霉素和它们的各比例复配药剂对番茄灰霉病菌的浓度梯度均为2、4、6、8、10 μg/mL。将中生菌素与纳他霉素预先配置成9:1、7:3、1:1、3:7和1:9的5个不同比例母液，将不同浓度母液与PDA混和，配制成终浓度为2、4、6、8、10 μg/mL的培养基，将直径5 mm的番茄灰霉病菌菌饼接种于上述含药PDA培养基平板上，25 ℃培养4 d。每个浓度3个培养皿，该试验重复2次。计算不同浓度药剂对番茄灰霉病菌菌丝生长的抑制率和EC50，抑制率（%）＝（对照菌落直径－处理菌落直径）/（对照菌落直径－菌饼直径）×100。

用SPSS 20进行数据分析并计算回归方程、相关系数r和EC50。采用Wadley法进行增效作用评价[8]。当增效系数SR＞1.5为增效作用，0.5≤SR≤1.5为相加作用，SR＜0.5为拮抗作用。具体公式如下：

式中：A和B分别代表两种药剂，a和b分别代表两种药剂在混剂中所占比例，obs为测定值，EXP为理论值。

1.2.2 孢子萌发抑制试验 采用凹玻片法[9]检测不同比例复配药剂对番茄灰霉病菌的孢子萌发抑制率。设置药剂比例和浓度与1.2.1相同。

1.2.3 田间药效试验方法 试验于河北省廊坊市九州镇冷棚进行，番茄品种为普罗旺斯（广东金作农业科技有限公司），每亩定植约3000株，该地区种植番茄10年，灰霉病连年发生，栽培品种一致，长势相同，水肥管理水平一致，符合试验标准。

试验共设置6个处理，药剂为500倍稀释的中生菌素、纳他霉素、中生菌素和纳他霉素可湿性粉剂复配制剂1、2、3，各制剂中药剂总含量为3%，其中复配制剂1、2、3中生菌素与纳他霉素含量配比为9:1、1:1和7:3，对照为清水。每个处理小区10 m2，每处理设3个重复。用15 L高品质压力喷壶均匀施药，每个处理间隔7 d施药一次，连续施药两次，第二次施药7 d后从每个小区随机选取3株调查全部果实和叶片发病情况。根据病情指数计算防病效果。叶片病情分级标准：0级：没有病斑；1级：病斑面积低于整个叶面积的5%；3级：病斑面积大于等于5%，低于10%；5级：病斑面积大于等于10%，低于20%；7级：病斑面积大于等于 20%，低于50%；9级：病斑面积大于50%。番茄果实病害分级方法[10]：0级：没有病斑；1级：残留的花瓣或柱头发病；3级：柱头发病蔓延到果脐部或萼片发生腐烂；5级：果脐部有润湿斑没有霉层；7级：果脐部有霉层但没有蔓延到其他部分；9级：霉层由果脐扩展到果的其他部分。

式中：ID为病情指数；Nn为各级病叶/果数；n为相对级数值；Nt为调查总叶/果数。P为防治效果，%；CK0为空白对照区施药前病情指数；CK1为空白对照区施药后病情指数；PT0为药剂处理区施药前病情指数；PT1为药剂处理区施药后病情指数。

2 结果与分析

2.1 复配制剂对番茄灰霉病菌的抑制作用

中生菌素与纳他霉素均对番茄灰霉病菌生长有着较好的抑制作用，EC50分别为1.9405和6.1186 μg/mL，中生菌素对番茄灰霉病的毒力优于纳他霉素。当中生菌素与纳他霉素比例为 9:1和 1:1时，增效系数SR＞1.5，表现为增效作用；中生菌素与纳他霉素比例为7:3、3:7和1:9时，0.5≤SR≤1.5，表现为相加作用（表1）。

2.2 复配制剂对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制作用

孢子萌发抑制试验表明，中生菌素和纳他霉素单剂对番茄灰霉病菌的孢子萌发抑制效果均较好，EC50分别为5.2137和8.8219 μg/mL，中生菌素优于纳他霉素。当中生菌素与纳他霉素比例为9:1、7:3和1:1时，增效系数SR＞1.5，表现为增效作用；中生菌素与纳他霉素比例为3:7和1:9时，0.5≤SR≤1.5，表现为相加作用（表2）。

表2 中生菌素和纳他霉素复配制剂对番茄灰霉病菌孢子萌发的抑制及增效作用Table 2 Synergistic inhibition of Zhongshengmycin and Natamycin on the conidial germination of B. cinerea

2.3 复配制剂对番茄灰霉病的田间药效

2.3.1 复配制剂对番茄叶片灰霉病的田间药效 中生菌素和纳他霉素单剂及其不同比例复配的可湿性粉剂对番茄叶片灰霉病的防效如表3所示。中生菌素和纳他霉素单剂配方的500倍液防效较差，分别为53.80%和44.37%。5种不同比例的复配制剂对番茄叶片灰霉病的防效存在显著性差异，当中生菌素与纳他霉素质量比为9:1和1:1时，对番茄叶片灰霉病防效显著高于单剂和其他比例，具有增效作用，防效分别为81.04%和74.00%。

表3 中生菌素与纳他霉素复配制剂对番茄叶部灰霉病的田间防效Table 3 Efficacies of Zhongshengmycin and Natamycin mixture in control of gray mold of tomato leaves in fields

2.3.2 复配制剂对番茄果实灰霉病的田间药效 中生菌素和纳他霉素单剂及其不同比例复配的可湿性粉剂对番茄果实灰霉病的防效如表4所示。与对叶片灰霉病防效趋势类似，中生菌素和纳他霉素单剂配方的 500倍液防效较差，分别为58.72%和 42.53%。5种不同比例的制剂对番茄果实灰霉病的防效存在显著性差异，中生菌素与纳他霉素为9:1时，对番茄果实灰霉病防治具有显著的增效作用，防效最好，可达78.48%；中生菌素和纳他霉素的比例为1:1和7:3时，防效略有下降，分别为71.16%和63.75%。

表4 中生菌素与纳他霉素复配制剂对番茄果实部灰霉病的田间防效Table 4 Efficacies of Zhongshengmycin andNnatamycin mixture in the control of gray mold on tomato fruits in fields

3 讨论

番茄灰霉病是发病严重且难于控制的病害，目前用于番茄灰霉病防治的药剂大多为化学药剂，但抗药性问题突出[11,12]。本研究首次引进生物抑菌活性物质纳他霉素与中生菌素进行复配，发现复配比例为 9:1和1:1时，两种药剂具有协同增效作用，为生物农药的合理增效使用提供了依据。

不同作用机理的农药混和，可能产生增效作用。张亚等[13]发现啶酰菌胺和咯菌腈的质量比为1:1和5:1等比例时，对草莓灰霉病菌有增效作用。本研究中中生菌素与纳他霉素以质量比9:1和1:1混和时，表现为增效作用，其中比例为9:1时增效系数达到3.6348，在该比例时，EC50为0.5730 μg/mL，与腐霉利和异菌脲抑制番茄灰霉病菌的EC50值0.22和0.44 μg/mL[14]接近。目前生产中防治灰霉病比较好的化学药剂40%嘧霉胺750倍液对番茄灰霉病的盆栽防效为80.63%，田间防效为75.55%[15]。本研究中，中生菌素和纳他霉素混和制剂对番茄灰霉病在叶片和果实上的防效分别达到81.04%和78.48%，与40%嘧霉胺的防病效果接近，具有很大的应用潜力。