王凤艳，王翔宇，贺小云，刘秋月，马琳，储明星，狄冉

（中国农业科学院北京畜牧兽医研究所，农业农村部动物遗传育种与繁殖重点实验室，北京 100193）

作为一种重要的家养动物，绵羊为人类提供了优质肉、毛、皮、奶等必需品，在畜牧业发展中发挥了重要作用。然而，目前我国绵羊产业存在发展不平衡、生产效率低下的问题，因此，提高绵羊的繁殖效率和肉用生产性能势在必行。绵羊产羔数作为一个低遗传力性状，受到遗传和环境等多种因素的共同控制，其中遗传因素尤其重要。利用传统的育种技术提高绵羊的繁殖效率不仅耗时长，效果也不明显，而通过标记辅助选择可以加快遗传进展。目前，鉴定到的绵羊多羔主效基因包括和等，其中基因是中国绵羊多羔主效基因，和是欧洲绵羊多羔主效基因。

本团队前期对国内单羔绵羊品种和多羔绵羊品种进行了全基因组重测序，筛选到了与产羔数相关的候选基因——基因（JAZF Zinc Finger 1）及其多态位点（Oar_v3.1 中4 号染色体68263669 bp 位点），该位点的值为0.63。基因是一种新型的转录辅助因子，具有抑制乳头状甲状腺癌细胞增殖、促进细胞凋亡、调节糖脂代谢、促进心肌微血管内皮细胞增殖和血管生成的作用，对脂肪细胞内脂肪素的表达也有一定的调节作用。研究表明，敲除会使人类精原干细胞周围蛋白A2 的合成减少，这对男性不育症的分子治疗提供了新的见解。此外，研究发现，基因对牛的产奶量、繁殖、体型、毛色等性状产生一定的影响。但目前未见基因与绵羊多羔性状有关的报道。

小尾寒羊具有性早熟、常年发情、多羔等优异繁殖性状，其适应性强，常被用来作为母本杂交改良其他品种。之前研究报道，与野生型相比，携带突变的小尾寒羊产羔数随突变拷贝数的增加而增加。然而，在小尾寒羊群体中发现不携带突变的个体仍然有产多羔的现象，这说明在小尾寒羊中很可能存在其他多羔主效基因或突变，进一步挖掘其他的多羔基因及其突变，分析基因间的协同效应，将有助于发现新的分子标记。本研究首先分析了基因和基因在小尾寒羊中的多态性以及对小尾寒羊产羔数的影响，接着分析了上述2 个基因对小尾寒羊多羔的协同效应，以期为绵羊多羔性状的遗传标记开发提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 实验材料 于山东省郓城县诚联小尾寒羊种羊场选择饲养管理条件一致、3 岁、健康、经产的小尾寒羊母羊362 只进行实验。

1.2 样品的采集与DNA 的提取 对362 只小尾寒羊颈静脉采血3 mL，采集后的血液样品用EDTA 进行抗凝处理，并于-20℃冰箱储存。使用天根血液基因组提取试剂盒（天根生物科技有限公司，北京）进行血液DNA 的提取，对提取的DNA 样品用Nano Drop 2000进行浓度检测，1.5% 琼脂糖凝胶电泳进行质量评估，选择合格的样品进行后续的实验分析。

1.3 基因分型 采用Sequenom MassARRAYSNP 分型技术对绵羊4 号染色体基因68263669 bp（Oar_v3.1）位点进行分型。PCR 扩增及延伸引物序列如表1所示，所有引物由苏州泓迅生物科技有限公司合成。采用TaqMan 探针分型技术对绵羊6 号染色体位点分型，探针及引物序列如表2 所示。荧光定量反应体系为：ddHO 1.1 μL，2×Master Mix 3.0 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.3 μL，2 种探针引物（10 μmol/L）各0.15 μL。荧光定量PCR 反应条件为：95℃10 min（孵育），95℃30 s（解链），60℃1 min（延长），共40个循环。

表1 Sequenom MassARRAY®SNP 分型引物序列信息

表2 FecB-TaqMan 探针及引物序列信息

1.4 数据分析 使用Microsoft Excel 2019 软件计算小尾寒羊基因68263669 bp（Oar_v3.1）位点和突变位点的基因型频率、等位基因频率、杂合度（He）、多态信息含量（PIC）、有效等位基因数量（Ne）等参数，并用卡方检验检测这2 个位点在该群体中的Hardy-Weinberg 平衡状态。>0.05 时认为处于Hardy-Weinberg 平衡。采用最小二乘法分析基因68263669 bp 位点和突变位点的基因型与产羔数的关联性，其线性模型为y=+G+G+GG+e。该模型中y 代表产羔数的表型值；表示群体均值；G表示基因68263669 bp 位点的基因型效应；G表示突变位点的基因型效应；GG代表基因68263669 bp 位点和突变位点之间的协同效应；e表示随机误差。数据分析由SPSS 20.0 完成，所有结果用“平均值±标准误”表示。

2 结果与分析

2.1 小尾寒羊基因g.68263669G>A 位点多态性分析 通过基因分型发现，基因g.68263669G>A位点在小尾寒羊群体中存在3 种基因型：AA 型（165只）、AG 型（191 只）和GG 型（6 只），如图1 所示。对小尾寒羊进行群体遗传学分析，结果如表3 所示：基因g.68263669G>A 位点和突变位点均为中度多态（0.250.05），但是基因g.68263669G>A 位点处于不平衡状态（<0.05）。

表3 小尾寒羊JAZF1 基因g.68263669G>A 位点和FecB 突变位点的群体遗传分析

图1 小尾寒羊JAZF1 基因g.68263669G>A 位点分型结果

2.2基因g.68263669G>A 位点和突变位点与小尾寒羊产羔数的关联分析 由表4 可知，对于g.68263669G>A 位点，GG 型个体产羔数显著高于AA型和AG 型个体。对于突变位点，产羔数随突变拷贝数的增加而显著增加。

表4 JAZF1 基因g.68263669G>A 位点和FecB 位点不同基因型小尾寒羊产羔数的最小二乘均值及标准误

2.3基因g.68263669G>A 位点与突变对小尾寒羊产羔数的协同效应分析 由表5 可知，同时携带和g.68263669G>A 纯合突变的小尾寒羊母羊（GGGG 型）产羔数显著高于单独携带任一突变的母羊产羔数。

表5 g.68263669G>A 与FecB 位点对小尾寒羊产羔数的协同效应

3 讨 论

JAZF1 是一种锌指蛋白，是细胞中代谢应激的主要介质，能增加细胞对凋亡的敏感性。是孤儿核受体TAK1 的共阻遏物，而大多数孤儿核受体家族成员参与脂质代谢的调节，因此，可能与糖脂代谢和脂代谢密切相关。目前对基因的研究主要集中在癌症、糖尿病等疾病上。与（PHD Finger Protein 1）基因的融合还与子宫内膜间质肉瘤的发生有关，子宫内膜间质肉瘤导致雌激素和孕激素受体阳性率较高，对女性生殖有一定的影响。基因编码包含3 个假定的锌指基序的27 kd 核蛋白，其在肝脏、脂肪和睾丸等组织中广泛表达。Ma 等研究表明基因可作为与性腺发育相关的差异表达的miRNA 和lncRNA 的靶基因。Fu 等研究表明基因沉默会抑制人类精原干细胞（SSC）增殖和DNA 合成，并促进SSC 的凋亡，该基因的敲低导致人类SSC 中细胞周期蛋白A2 的减少，因此对治疗男性不育症具有重要意义。上述研究表明该基因对动物的繁殖具有一定的调控作用。而基因在绵羊繁殖方面的研究鲜有报道。

本文对基因多态性及其与产羔数的关联进行研究，发现基因g.68263669G>A 位点与小尾寒羊产羔数显著相关，该突变可以显著提高小尾寒羊的产羔数（<0.05），是一个有利突变，暗示该突变可能参与了绵羊的繁殖调控，但其具体的作用机制还有待于进一步研究。

突变可引起BMPR1B 信号减弱，导致FSHR和LHR 分泌增加，提高对FSH 和LH 的敏感性，减少颗粒细胞凋亡以增加绵羊排卵率，从而提高绵羊的产羔数。突变显著增加了小尾寒羊和湖羊的产羔数，是导致这2 个品种多羔的关键基因。本研究中产羔数随突变拷贝数的增加而显著增加的结果与上述发现一致。另外，对同时携带和g.68263669G>A突变母羊的产羔数分析发现同时携带2 个突变的小尾寒羊母羊产羔数显著高于单独携带任一突变的母羊产羔数，表明和g.68263669G>A 突变对小尾寒羊产羔数存在一定的协同效应。之前Chu 等研究结果表明，同时携带和突变的小尾寒羊母羊产羔数要显著高于携带一个突变的个体。Hanrahan 等研究发现同时携带和突变的母羊具有更高的排卵率。另外，同时携带、以及基因突变的母羊排卵率较高，并且这些基因对排卵数也显示出协同作用。

4 结 论

绵羊基因g.68263669G>A 位点可能是提高绵羊产羔数的潜在的有效标记。该位点和突变对产羔数有一定的协同效应。