成晨亚琼，赵鹏涛,2,，王晓宇,2,,，王升楠，赵擎豪，杜国荣，黄科，程玉文

（1.陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安 710119；2.西部果品高值利用教育部工程研究中心，陕西西安 710119；3.西安文理学院生物与环境工程学院，陕西西安 710065；4.宁波市跨境电子商务促进中心，浙江宁波 315000）

我国苹果资源极为丰富，产量达4000 多万吨，占世界总产量的52%，果品产业经济效益显著。目前，苹果汁是我国苹果加工的主要方向，其中非浓缩还原苹果汁具有低温鲜榨、无菌灌装、冷链储运等特点，能极大保留苹果的营养价值而受到广大群众的喜爱。但在加工和贮藏过程中，因多种外在因素，如温度、pH 和光照等的影响，苹果汁容易发生氧化反应而产生褐变，不仅会导致苹果汁颜色和香气劣变、储藏期缩短，还会降低其营养价值和商业价值。因此，抑制苹果汁的褐变非常关键。

当前，国内外学者对使用抗氧化剂抑制果汁氧化褐变的机理和方法进行了广泛的研究，但对苹果汁的抗氧化研究较少。抗坏血酸、二氧化硫和谷胱甘肽是国内外广泛使用的食品添加剂，具有抑制氧化酶活性和护色的作用，主要作抗氧化剂用于果汁和酿酒工艺中。除此之外，苹果中天然含有的内源抗氧化剂——苹果多酚，具有较强的自由基清除能力，现已应用于食品加工和营养保健等多个领域。

近年来，果汁加工生产中主要使用单一抗氧化剂来达到护色的效果，但普遍存在护色剂稳定性较差，甚至转变为促褐变剂的问题。多种护色剂之间的协同护色效果显著，但对其协同性的研究还相对缺乏，且大多基于实验室水平。本文将从苹果汁的氧化褐变机理、常用抗氧化剂的作用机理以及抗氧化剂协同护色技术研究思路展开系统综述，旨在为苹果汁的褐变问题解决提供理论依据和新思路。

1 苹果汁氧化褐变反应

苹果汁中的氧化反应主要分为酶促褐变和非酶促褐变，二者实质是苹果中酚类物质的氧化。苹果中富含酚类物质，但不同的酚类物质反应途径和机制各不相同，例如儿茶素、没食子酸、咖啡酸等，既可通过酶促褐变又可经非酶途径褐变，进而加深果汁颜色。酶促褐变主要发生在前期，而非酶褐变长时间存在，且两种反应所造成的褐变程度及反应产物也不同。

1.1 酶促褐变机理

酶促褐变是在有氧条件下，多酚氧化酶催化多酚反应生成醌类物质，并进一步聚合成黑色素，促使苹果汁的色值变低的复杂反应，反应中各物质的特征见图1。

图1 酶促氧化物质的特征Fig.1 Characteristics of enzymatic oxidizing substances

研究表明，多酚氧化酶是一种含Cu的金属酶，分为单酚酶即酪氨酸酶、双酚氧化酶即儿茶酚氧化酶以及漆酶，通常指的多酚氧化酶是儿茶酚氧化酶和漆酶。多酚氧化酶作为催化酶促褐变发生的动力基础，是控制反应发生的关键，现有研究中多对抑制氧化酶活性的方法进行研究。酚类物质也是影响酶促反应发生的重要因素，下文中具体叙述。

1.2 非酶促褐变机理

非酶促褐变主要发生在苹果汁的生产贮藏过程中，包括美拉德反应、焦糖化反应、抗坏血酸氧化分解反应以及多元酚氧化缩合反应，不仅会引起氨基酸、蛋白质等营养物质含量的减少，产生有害物质，还会引起颜色、风味等感官品质下降。美拉德反应和焦糖化反应在苹果汁中主要形成糠醛及类黑精色素来影响果汁的品质。抗坏血酸具有酸性和还原性的特点，在体系中氧化分解后能够与游离氨基酸反应生成红色素及黄色素，但在苹果中含量低且加工过程中损失量大，因此不作为非酶褐变的主要原因。多元酚氧化缩合反应中，苹果富含多种酚类物质，且所含的酚类物质化学性质活泼，易形成苯醌进而发生多种反应，是导致苹果汁褐变发生的主要原因。

1.3 苹果汁中的酚类物质在褐变过程中的作用

苹果汁中常见的酚类物质有儿茶素、表儿茶素、绿原酸、根皮素、槲皮素、原花青素等，这些酚类物质积极参与酶促反应及非酶促反应被氧化成醌类物质，并进一步聚合形成呈色物质使苹果汁发生褐变，但酚类物质的种类和含量不同对褐变程度的影响也不同。董新玲测定了绿原酸、儿茶素、表儿茶素和根皮苷在模拟果汁中发生的非酶褐变，结果表明随着时间的延长，果汁白度和亮度降低，体系变黄，儿茶素和绿原酸呈色微红，表儿茶素呈色偏绿，而根皮苷自身褐变能力较弱。同时发现在苹果汁中表儿茶素和绿原酸含量最高。表1 总结了苹果汁氧化褐变过程中影响苹果汁褐变的主要酚类物质的氧化反应及其醌类衍生物的特性。

表1 影响苹果汁颜色的主要多酚及其特性苹果中对颜色起主要作用的多酚及其特性Table 1 Main polyphenols affecting the color of apple juice and their characteristics

绿原酸主要在多酚氧化酶和氧气的催化下反应生成绿原酸p-醌，并可以进一步聚合，且该产物可促进其他酚类物质的氧化。少量的儿茶素、表儿茶素会参与酶促褐变，主要发生非酶褐变形成邻苯醌类化合物再进一步聚合生成茶黄素或茶红素类物质。表儿茶素可在香蕉匀浆液中的酶作用下氧化聚合成表儿茶素的三聚体；在过氧自由基的作用下可以形成原花青素。儿茶素可以在加热的条件下发生自氧化形成茶黄素。根皮苷是苹果中的特征多酚，其化学性质稳定无自身聚合反应发生，主要在多酚氧化酶作用下逐渐由微黄色变为橙红色的氧化产物POP2。原花青素B具有多电子的羟基结构，极易发生氧化反应，每分子具有八个酚羟基可以捕获8 个氧自由基，通过加成反应生成稳定呈色物质。槲皮素可以在水相环境中失去两电子而自身被氧化为醌类衍生物。此外，汪晓谦研究了红肉苹果和非红肉苹果的抗氧化能力，发现总酚和总花青素含量与多酚的抗氧化能力成正比，因此也被用作评价苹果汁品质的重要指标。在实际生产中可通过选择苹果的品种及成熟度来控制苹果汁中所含多酚的种类和含量抑制褐变。果汁中温度和pH 的升高也会促进多酚物质的分解，而发生褐变，例如苹果中的叶绿素、花色苷等色素物质，其化学性质不稳定，氧化分解后会生成不良的有色物质，加剧果汁颜色的劣变。

1.4 影响苹果汁褐变的环境因素

温度是影响苹果汁褐变发生的主要原因之一。在苹果汁加工中，控制苹果原料的加工温度可以很好地抑制酶促褐变并保留苹果所含的营养物质和风味品质。非酶促反应中，温度升高在30 ℃以上会促进美拉德反应的发生速率，同时也会间接影响酶促褐变，当温度达到氧化酶最适温度时就会促进氧化反应发生。在苹果汁的杀菌环节中常采用热杀菌，例如巴氏杀菌和超高温瞬时杀菌等工艺，不仅可以起到杀菌作用也抑制了酶促褐变反应的发生。在pH 的影响下，非酶褐变中当pH 大于3 时抗坏血酸不稳定易分解发生褐变。在酶促褐变中，pH 对酶活性产生的直接影响可以抑制酶促褐变反应的发生。氧气作为酶促反应发生的必要条件，空气中的分子态氧气在多酚与多酚氧化酶接触时，促进形成易褐变的羟基醌。采取抗氧化剂或真空包装等措施能够把果汁中氧气及时去除，同时满足褐变抑制需求，降低果汁褐变的程度。

2 常见的苹果汁抗氧化剂

2.1 苹果多酚

苹果多酚是苹果中具有苯环并结合多个羟基化学结构的总称，其类型、结构和含量与苹果汁的颜色、风味和香气密切相关。苹果中的多酚主要包括酚酸类和类黄酮类等，其中绿原酸、根皮苷等含量极高是主要的酚类物质。贺金娜对红富士苹果中的绿原酸、表儿茶素及根皮苷的抗氧化性进行了研究，发现其抗氧化性与人工合成抗氧化剂TBHQ无差异，且绿原酸和根皮苷的抗氧化效果高于抗坏血酸。张影陆等研究发现，在酶促氧化反应过程中，绿原酸的聚合度相对于儿茶素聚合度的增加程度更大，说明绿原酸更易与酶发生反应，是多酚氧化酶催化的较适底物，对果汁的口感和产品稳定性的影响更大。以表1 中绿原酸酶促反应为例，在绿原酸酶促反应过程中，苹果多酚的酚羟基与氧化应激产生的自由基反应，形成了相对稳定的半醌式自由基结构，从而阻止了绿原酸醌类物质的形成，发挥了抗氧化作用。综上，苹果多酚作为一种天然抗氧化剂，在苹果汁的加工工艺中，可以通过原料环节的甄选来控制潜在的促褐变酚类物质，改变氧化速率，影响褐变反应发生的程度。

作为苹果内源性的抗氧化剂，苹果多酚在其他果蔬汁加工中也有应用。有研究提到绿原酸可以显著提高草莓果汁的稳定性。张舒翼等研究发现根皮苷添加于低酯果胶中，果胶的抗氧化性与根皮苷的添加量呈正比，说明根皮苷具有提高果汁抗氧化性的能力。孙建霞研究了苹果多酚对胡萝卜汁的护色作用，发现苹果多酚浓度为0.10 g/100 mL 时可以很好地保护-胡萝卜素，果汁护色效果最佳。若加入的苹果多酚超出某一临界量时，虽然高质量浓度具有一定的活性诱发效应，但苹果多酚及其氧化产物均具有酸性，导致溶液的酸性增大，抗氧化作用降低，使得胡萝卜汁发生褐变。选择合适的添加量与苹果汁抗氧化效果和最终效益密切相关。

2.2 抗坏血酸

抗坏血酸是一种结构类似葡萄糖的多羟基化合物，其分子中的烯醇式羟基极易解离释放H，被氧化成脱氢抗坏血酸。抗坏血酸与脱氢抗坏血酸之间存在可逆反应，且两者具有相同的生理功能。但在一定条件下，脱氢抗坏血酸可继续反应，水合形成2，3-二酮古洛糖酸，脱水、脱羧后形成糠醛，再形成褐色素，此时反应不可逆。

抗坏血酸通过逐级供给电子而转变为半脱氢抗坏血酸和脱氢抗坏血酸的过程，有效清除了体内的自由基。其抗氧化作用主要通过三个途径：将醌还原成酚、与金属离子螯合、直接被PPO 氧化竞争。以表1中绿原酸酶促反应为例，抗坏血酸抑制绿原酸酶促氧化反应通过：a.烯醇式羟基中的H使绿原酸醌类产物还原为绿原酸及羟基绿原酸；b.抗坏血酸与多酚氧化酶中的Cu发生螯合反应；c.与多酚氧化酶发生氧化还原反应。抗坏血酸抗氧化特性机制具体如图2。

图2 抗坏血酸抗氧化特性机制示意图Fig.2 Schematic diagram of antioxidant mechanism of ascorbic acid

抗坏血酸的使用浓度也会影响其抗氧化效果。抗坏血酸及其钠盐在添加量少时表现出较好的抗氧化性，但超出某一临界量后不仅会促进氧化褐变，还会直接影响苹果汁的风味。因此，作为抗氧化剂时抗坏血酸的规定加入量为原料的千分之五。根据原料的不同，将适宜质量分数的抗坏血酸加入到产品中，可起到有效的抗氧化和抑菌等作用。此外，与上述抗氧化剂相比，抗坏血酸的护色效果及稳定性低于二氧化硫和谷胱甘肽，但在抗氧化剂的选择上抗坏血酸适用的原料更广泛，对人体而言更健康。HERBIG等报道，抗坏血酸在食品中的稳定性差，易氧化分解与游离氨基酸反应生成色素加深体系颜色，且抗坏血酸加入果汁后，反应生成的中间产物HO会破坏花色苷的吡喃环，生成无色的酯类降解物，加热后分解聚合形成棕褐色的沉淀，因此多种抗氧化剂的协同护色是未来的研究方向。

2.3 二氧化硫

二氧化硫作为主要的抗氧化剂，通常以焦亚硫酸钾、焦亚硫酸钠、亚硫酸钠、亚硫酸氢钠等亚硫酸盐的形式应用于食品加工中，但其添加方式和添加量对果汁的品质有着明显的影响。我国国标明确规定了二氧化硫可作为抗氧化剂、防腐剂和漂白剂等的添加量，合适的添加量能起到抑菌、增酸、溶解和抗氧化等作用，而过量或长期使用会危害人体健康。

二氧化硫添加到苹果汁中涉及多种复杂的生化反应，主要机制总结为：抑制氧化酶活性；所形成的亚硫酸盐与体系中的氧反应生成硫酸和硫酸盐，消耗体系中的含氧量。Danilewicz进一步说明，二氧化硫与邻二酚氧化产生的醌类物质发生了还原反应，抑制醌类的聚合，从而降低褐变的程度。此外二氧化硫的抗氧化性还取决于二氧化硫在氧化过程中还原过氧化物的能力。式（1）为亚硫酸抗氧化特性反应式：

2.4 谷胱甘肽

谷胱甘肽（glutathione，GSH）是一种由谷氨酸、半胱氨酸及甘氨酸缩合形成的三肽化合物，其所含有的活性硫醇成分赋予了自身抗氧化活性。YIN 等推测谷胱甘肽存在两种形式，包括还原型的谷胱甘肽和谷胱甘肽二硫化物（glutathionedisulfide，GSSG）。研究发现，在谷胱甘肽过氧化物酶（glutathione peroxidase，GSH-Px）催化下GSH 可以转化为GSSG 和水，而GSSG 也可以在谷胱甘肽还原酶（glutathionereductase，GR）作用下，以NADPH 辅因子转化为GSH，共同构成图3 中GSH 的还原系统。徐菁苒等研究发现GSH 抑制苹果汁褐变能力优于抗坏血酸和L-半胱氨酸，在食品工业中常作为单酚保护剂、褐变抑制剂和风味调节剂，具有作为苹果汁护色剂的研究潜力。

图3 还原型谷胱甘肽与氧化型谷胱甘肽的氧化还原反应Fig.3 Redox reaction between reduced glutathione（GSH）and oxidized glutathione（GSSG）

还原型谷胱甘肽作为抗氧化剂，其半胱氨酸的残基部分是生物化学性质及抗氧化的作用位点。巯基作为亲核中心具有丰富的电子，能够与邻羟基醌类化合物结合，形成无色稳定的2-S-谷胱甘酰咖啡酸来阻碍醌类化合物之间的缩合反应，有效地抑制褐变。以表1 绿原酸酶促反应为例，谷胱甘肽能够与绿原酸中醌类化合物反应，阻断绿原酸的氧化反应。同时，谷胱甘肽还可以与醛类化合物结合，抑制多酚氧化酶活性。然而谷胱甘肽对于酶促氧化反应和非酶促氧化反应的作用是不同的。酶促褐变反应发生在添加谷胱甘肽之前，无法抑制多酚的氧化，但是可以对酶促氧化产生的醌类物质进行抑制，改善氧化环境，抑制非酶促氧化反应。谷胱甘肽作为抗氧化剂可以与多种氧化物质反应控制氧化反应的进程，在实际操作中需注意谷胱甘肽的添加时间，有效合理地选择对不同褐变反应起作用的添加剂。谷胱甘肽抗氧化机制具体如图4。

图4 谷胱甘肽抗氧化特性机制Fig.4 Antioxidant mechanism of glutathione (GSH)

谷胱甘肽的添加量对苹果汁品质也有影响。DU 等研究了不同浓度谷胱甘肽对罐装苹果汁褐变的影响，发现0.08%谷胱甘肽处理过的苹果汁中，对多酚氧化酶活性的抑制率可达99.8%，褐变程度显著降低。谷胱甘肽在苹果汁中可以作为抗氧剂使用，关于苹果汁加工使用的信息仍然很少，还需要进一步的研究来确定生产不同类型苹果汁所需的谷胱甘肽添加方式及浓度，以期达到更好的护色效果。谷胱甘肽也被用于果酒加工过程中的护色和抗氧化。WEBBER 等的研究结果表明添加20 mg/L 的谷胱甘肽可以明显降低储藏到12 个月时起泡酒的颜色指数。XU 等通过研究不同浓度的谷胱甘肽对苹果酒品质的影响说明了谷胱甘肽对苹果酒的护色效果显著。

3 抗氧化剂协同护色

协同作用是指多种抗氧化剂共同使用，相比使用单一抗氧化剂的抗氧化效果更好。已有研究证明，生物抗氧化剂复合使用时具有协同作用。协同作用效果的比较方法有加和法、直接比较法、响应曲面法等，一般优先选用比色法测定果汁色度来判断抗氧化剂的护色效果。表2 为上述四种抗氧化剂的抗氧化特性及其协同护色特点。

表2 四种抗氧化剂的抗氧化特性及其协同护色特点Table 2 Antioxidant and synergistic anti-oxidation properties of four antioxidants on color protection

目前关于苹果多酚、亚硫酸盐、谷胱甘肽及抗坏血酸对苹果汁护色的协同作用研究相对较少，但从相关研究中发现，当谷胱甘肽、抗坏血酸混合使用时，对苹果汁的护色效果大于单一使用任一种抗氧化剂。Sonni 等对比加入不同抗氧化剂组分：单一二氧化硫、单一谷胱甘肽及谷胱甘肽复合抗坏血酸对白葡萄酒的颜色影响发现，由于抗坏血酸可以与多酚氧化酶的辅基络合降低酶的活性，而谷胱甘肽则阻止了醌的进一步聚合，当两者复合使用时对酶和中间物产生了双重抑制作用，所以抗坏血酸和谷胱甘肽组合的护色效果显著。米桂等通过对抗坏血酸、柠檬酸、蜂蜜和壳聚糖进行复配研究，发现多种护色剂之间具有一定的协同护色效果。同时，研究表明谷胱甘肽和二氧化硫在提高耗氧率方面显示出较好的协同作用。赵光远将多种抑褐变剂单一或复合使用于浑浊苹果汁加工中研究其护色性能，结果表明抗氧化剂的协同护色可以达到对酶、醌及底物等的多重抑制作用，从而加强褐变抑制率。

在抗氧化剂的协同护色的机理方面，盛雪飞等解释存在三种机理：多种抗氧化剂之间的修复再生形成了氧化还原的循环系统；通过偶联氧化导致抗氧化剂间的电位差降低；多种抗氧化剂共同作用减少了体系中的氧气等。此外，不同护色剂的作用对象不同，复合使用时可以达到对底物、酶、中间物等物质的多重抑制从而增加护色效果，具体如图5。

图5 四种抗氧化剂协同护色抗氧化特性机制Fig.5 Synergistic anti-oxidation mechanism of four anti-oxidants on color protection

总体而言，多种抗氧化剂在反应体系中的协同作用可以优化护色效果，既可以弥补护色剂添加量不足时护色效果差的缺陷，又可避免过量使用所带来的危害。值得注意的是，在实际生产中多种抗氧化剂复配使用时，需考虑多种实际影响因素，如护色剂的浓度、反应体系等。

4 结论与展望

尽管苹果汁加工过程中通过对温度、pH 等外在因素的控制可以达到一定的护色效果，但其氧化机理复杂，褐变问题依然未得到良好的解决。抑制苹果汁的褐变是一个综合的、多因素控制的问题，而目前的添加剂使用以单一抗氧化剂为主，效果差，问题多，多种抗氧化剂协同护色可以很好地解决这些问题。本文通过浅析苹果汁的氧化褐变机理和苹果多酚、二氧化硫、谷胱甘肽及抗坏血酸这四种抗氧化剂的护色作用机制，为研究苹果汁的专用抗氧化剂和护色剂的开发提供了参考。