田林平，张琪，李瑞，任小林

（西北农林科技大学园艺学院，陕西杨凌 712100）

苹果（Borkh）因其脆甜多汁的口感以及丰富的维生素和矿物质深受大众喜爱。一个综合品质优良的苹果不仅能够提高消费者的食欲及购买欲，同时能够增强其市场竞争力，提高果农的收益。苹果果实品质不仅受质地、色泽、固酸比、成熟度和果形指数的影响，而且与其挥发性物质密切相关。现已有大量水果的挥发性物质被鉴定，其中草莓中鉴定出100 余种，葡萄中99 种，梨中300余种，香蕉中44 种，苹果中350 多种。

水果果实中的挥发性物质包括：酯类、醇类、醛类、酮类、酸类、萜烯类、含硫化合物和酚类。苹果果实挥发性物质以酯、醇、醛类物质为主，其中酯类物质是主要的呈香物质，如丁酸酯、丁酯、2-甲基丁酸酯、2-甲基丁酯、己酯、己酸酯等，此外，不同品种苹果主要呈香物质不同，如‘蜜脆’苹果以2-甲基-丁酸乙酯和丁酸乙酯为主；‘红玉’苹果以己醇、3-甲基丁醇为主；嘎啦系苹果以乙酸己酯、乙酸丁酯、2-甲基乙酸丁酯为主；富士系苹果以2-甲基乙酸丁酯和2-甲基丁酸乙酯为主。其中呈甜香的乙酸丁酯、呈苹果香的2-甲基丁酸乙酯、2-甲基乙酸丁酯、丁酸乙酯对它们的香气贡献起了重要作用。

此外乙烯处理、1-MCP 处理、气调贮藏、冷藏以及相关前体的添加均会影响苹果果实挥发性物质的产生。苹果果实中的挥发性酯类物质主要来自于脂肪酸代谢途径和氨基酸代谢途径，其中醇类物质和酰基-辅酶A 在醇酰基转移酶的作用发生酯化反应生成酯是关键的一步。已有报道表明苹果整果可以吸收外源醇，并将其转化成相应的酯类物质，Harb用丁醇，己醇，戊醇作为香气前体处理‘金冠’苹果，在超低氧环境下贮藏6 个月，发现其乙酸己酯、乙酸丁酯、乙酸戊酯的含量显著增加。Lee 等用正丁醇、2-甲基丁醇、正己醇处理‘富士’苹果，发现乙酸丁酯、丁酸丁酯、丙酸丁酯、己酸丁酯、辛酸丁酯、2-甲基丁酸丁酯、2-甲基乙酸丁酯、乙酸己酯含量均显著增加。丁醇作为苹果中主要的挥发性醇类物质以及酯类合成的重要前体物质，已受到广泛关注，本研究通过不同浓度的外源正丁醇处理‘粉红女士’苹果果实，分析其对苹果果实贮藏期间内源挥发性酯类物质的影响，旨在为挥发性物质合成及代谢途径的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

‘粉红女士’苹果 陕西省扶风县天度镇一商业果园；正丁醇 色谱级（浓度≥99.5%），Sigma-Aldrich公司；3-壬酮 HPLC 级（浓度≥99.7%），Alfa Aesar公司；乙醇 分析级（浓度≥99.7%），四川西陇科学有限公司；甲基叔丁基醚 色谱级（浓度≥99.9%），阿拉丁试剂有限公司。

7890B-5977B 型气相色谱质谱联用仪、色谱柱（HP-5MS）美国Agilent；SB25-12DTD 型超声清洗机 浙江宁波新芝生物科技股份有限公司；D-37520 型离心机 美国Thermo Fisher 公司；氮吹仪杭州奥盛仪器有限公司；QT-1 涡旋仪 上海琪特分析仪器有限公司。

1.2 实验方法

1.2.1 材料处理 本试验所用材料‘粉红女士’苹果（Borkh‘Pink Lady’）果实于2017 年10 月30 日采自陕西省扶风县天度镇一管理良好的商业果园。挑选大小一致，着色均匀，成熟度一致，无机械损伤，无病虫害的570 个果实，采收后立即运往西北农林科技大学采后生物学实验室，室温放置24 h 散去田间热。根据先前的预实验（处理浓度分别为25、50 和100 μL·L），确定本实验的处理浓度为10 和25 μL·L。实验分为3 组，对照组培养皿中仅放置滤纸，不添加任何溶剂，处理组培养皿中放入滤纸后分别添加3.6 和9 mL 的正丁醇（浓度分别为10 和25 μL·L）。将苹果和装有滤纸的培养皿放置于容量为360 L 的气调箱内密闭熏蒸，熏蒸时间为24 h，温度为20±0.5 ℃。处理结束后用聚氯乙烯（PVC）保鲜袋包装后放入纸箱内室温（温度：20±0.5 ℃，相对湿度：85%～90%）贮藏42 d，每隔7 d 每组随机挑选9 个果实取样，每3 个果实为一个重复，于−80 ℃冰箱保存。

1.2.2 挥发性物质的提取 本试验挥发性物质的提取采用有机溶剂萃取法，提取方法参考石金瑞等。用液氮研磨仪将从−80 ℃冰箱中取出的待测样品研磨成粉末；称取2 g 样品于10 mL 离心管中，并加入3 mL 的蒸馏水，3 mL 的甲基叔丁基醚（Methyl tertbutyl ether，MTBE）和10 μL 的内标[V（3-壬酮）:V（甲醇）=5:30000]，涡旋仪充分混匀。将混匀后的样品放入超声清洗机中，20 ℃超声萃取30 min，然后11000 r/min、4 ℃条件下离心15 min。吸取上清液1.5 mL，利用氮吹仪浓缩至500 μL，过滤后进行GC-MS 分析。

1.2.3 挥发性物质的定性定量分析 采用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）进行挥发性物质分析。分析条件：a.升温程序：起始温度40 ℃保持3 min，然后以每分钟5 ℃升温至180 ℃，再以每分钟8 ℃升温至300 ℃，保持2 min；b.色谱条件：色谱柱为HP-5MS，进样口温度为230 ℃，进样量为1 μL，不分流进样，载气：流速为1 mL/min 的氦气（浓度99.999%）；c.质谱条件：电子轰击离子源，电离能量70 eV，传输线和离子源温度均为240 ℃；质量扫描m/z 33～380。

挥发性物质的定性分析是根据GC-MS 得到谱图，利用Qualitative Analysis B.07.00 进行分析，结合标准品保留时间、质谱图、保留指数RI 以及NIST库比对确定。定量分析参照李瑞等的方法，由各标准品的校正因子（CF）计算得到各挥发性物质的含量，矫正因子计算过程如下：

式中：C是标准品浓度（μg/kg）；A是离子模式下标准品的峰面积；C是内标（3-壬酮）的浓度（μg/kg）；A是内标（3-壬酮）的峰面积。

被测物质浓度C的数值基于CF 的计算结果得来，具体计算过程如下：

式中：A是被测物质的峰面积；C是被测样品的内标浓度（μg/kg）；A是被测样品的内标面积。

1.3 数据处理

运用Excel 2010 软件对所得数据进行统计分析；使用IBM SPSS Statistics 25 进行显著性差异分析；采用R 软件进行主成分分析并作图；采用Origin 2021b 绘制柱形图。

2 结果与分析

2.1 正丁醇处理对‘粉红女士’苹果挥发性物质种类和含量的影响

利用气相色谱质谱联用仪（GC-MS）分析对照、10 和25 μL·L正丁醇处理后‘粉红女士’苹果贮藏42 d 内挥发性物质种类和含量的变化。在贮藏第0 d 共检测到25 种挥发性化合物（表1），包括酯类、醇类、醛类和其他类；其中酯类物质最丰富，包括乙酸丁酯、乙酸-2-甲基丁酯、丁酸丙酯、乙酸戊酯、丁酸丁酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸丁酯、丙酸己酯、2-甲基丙酸己酯、己酸丁酯、丁酸己酯、2-甲基丁酸己酯、己酸己酯、辛酸丁酯以及辛酸己酯。随着贮藏时间的增加，挥发性物质种类逐渐减少，在对照组以及两种浓度的正丁醇处理组，第7、14、21、28、35、42 d 均分别检测出25、24、24、22、20、20、20 种挥发性物质。此外，贮藏初期与贮藏末期相较，特有的物质有乙酸戊酯、丁酸丁酯、2-甲基-丙酸己酯、法尼醇和2-甲基丁酸。综上可知，正丁醇处理不会影响‘粉红女士’苹果挥发性化合物的种类，但随着贮藏时间的延长挥发性物质的种类逐渐减少。

表1 正丁醇处理对‘粉红女士’苹果贮藏期间挥发性物质的影响Table 1 Volatile substance content in ‘Pink Lady' apple treated with n-butanol

正丁醇处理能够影响贮藏前期‘粉红女士’苹果挥发性物质的含量，在对照及两种不同浓度的正丁醇处理后的整个贮藏过程中大部分挥发性物质呈现先升高后降低最后保持基本稳定的趋势。正丁醇处理组贮藏前期与对照相比，其挥发性物质含量上升显著（<0.05）（图1），尤其是25 μL·L处理组，此外，含量变化较大的物质有乙酸丁酯、丁酸丙酯、丁酸丁酯、2-甲基丁酸丁酯、己酸丁酯。在贮藏第7 d 时，25 μL·L处理组的乙酸丁酯含量为1836.37 μg/kg，是10 μL·L处理组的2 倍，对照组的3.6 倍；25 μL·L处理组的丁酸丁酯含量为703.12 μg/kg，是10 μL·L处理组的2.39 倍，对照组的3 倍，在贮藏14 d 时，25 μL·L处理组的丁酸丙酯含量为566.61 μg/kg，是10 μL·L处理组的1.5 倍，是对照组的1.6 倍；25 μL·L处理组的丁酸丁酯含量为219.67 μg/kg，是10 μL·L处理组的1.7 倍，处理组的1.5 倍。随着贮藏时间的延长，丁酯和丁酸酯类物质含量逐渐趋于稳定，可能是正丁醇的添加使得底物提前消耗完毕果实达到稳态，这与Harb 的研究一致，即醇类的添加仅影响了贮藏前期挥发性物质的产生。乙酸-2 甲基丁酯呈现出与其他酯类物质不同的情况，在贮藏前期其处理组挥发性物质含量显著（<0.05）低于对照组，并随着贮藏时间的延长不断降低，直至贮藏后期二者无显著差异（>0.05）。乙酸-2-甲基丁酯特异的表现，可能是由于前期2-甲基丁醇和丁醇竞争乙酰CoA，而乙酰CoA 优先与丁醇生成乙酸丁酯，当丁醇被消耗完毕，再与2-甲基丁醇结合生成2-甲基乙酸丁酯，在Harb的研究中，在‘金冠’苹果中添加丁醇，并在超低氧条件下贮藏，乙酸己酯含量显著降低，而乙酸丁酯的合成增加，是因为乙酸丁酯的合成消耗了乙酸己酯的合成前体乙酸。贮藏前期挥发性物质总和为78662.89～131940.18 μg/kg，贮藏后期仅为51779.72～110114.45 μg/kg，比贮藏前期挥发性物质总量减少，并且25 μL·L处理组挥发性物质含量下降幅度大于10 μL·L处理组和对照组。综上所述，25 μL·L正丁醇的处理在贮藏前期对促进香气释放的效果要明显优于10 μL·L的正丁醇处理，并且在相同处理条件下随着贮藏时间的增加，挥发性物质的种类和含量大都不断减少，尤其是25 μL·L处理组。

图1 不同浓度正丁醇处理对‘粉红女士’贮藏期酯类物质变化的影响Fig.1 Effects of different concentrations of n-butanol on changes of esters in ‘Pink Lady’ during storage

2.2 主成分分析

主成分分析是一种考察多个变量间相关性一种多元统计方法，研究如何通过少数几个主成分来揭示多个变量间的内部结构。为探究不同贮藏时间及正丁醇处理对‘粉红女士’苹果挥发性物质的影响，基于各样本香气物质的含量，进行了主成分分析，并制作得分图和载荷图（图2）。结果显示，当提取两个主成分时可解释原始变量总方差的63.6%，其中第一主成分（PC1）解释了总方差的48.7%，是区分不同贮藏时间以及不同处理挥发性物质差异的主要成分，第二主成分（PC2）解释了总方差的14.9%。根据得分图（图2A）可知，不同贮藏时期的‘粉红女士’苹果样本在PC1 方向被显著区分（三个处理贮藏0、7、14 d均位于PC1 的正半轴），说明引起不同贮藏时间苹果香气差异因素主要是PC1。在贮藏前期（0、7、14 d），同一贮藏时期不同处理组间的样本在PC2 方向被显著区分（对照组位于PC2 的正半轴，10 和25 μL·L处理组位于PC2 的负半轴）；而在贮藏后期，对照与两种处理组聚在一起。结合载荷图（图2B）结果可知每种挥发性物质的贡献率以及挥发性化合物和各样品之间的关系。在三个处理的整个贮藏期，使第0、7、14 以及21 d 的对照组位于PC1 正半轴的物质主要有：乙酸-2-甲基丁酯、乙酸戊酯、丙酸己酯、2-甲基丁醇、E-2-己烯醛、壬醛、2-甲基丁酸，使得第28、35、42 d 位于PC1 负半轴的主要物质有：丁酸丙酯、己酸己酯、辛酸己酯、己醛。在贮藏前期（0、7、14 d），导致对照组位于PC2 的正半轴的挥发性物质主要为2-甲基丙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、3-己烯醛、壬醛、法尼醇，其中法尼醇仅在贮藏0 d 时被检测到；导致其他两个处理组位于PC2 的负半轴的挥发性物质主要为乙酸丁酯、丁酸丁酯、乙酸己酯、2-甲基丁酸丁酯。

图2 正丁醇处理后不同贮藏时间25 种香气的主成分分析Fig.2 Principal component analysis of 25 fragrances treated with n-butanol during storage

不同贮藏时期‘粉红女士’苹果果实香气构成存在很大差异，正丁醇处理可能是通过影响丁酯的含量从而影响果实的香气构成。不同处理和贮藏方式对果实挥发性物质的影响已有报道，乙烯和低温处理富士苹果后与对照相比，挥发性物质种类先升后降，其中差异物质包括2-甲基-丁酸酯、己酸丙酯、己酸-2-甲基丁酯等。1-MCP 处理鸭梨果实后在不同程度上降低了其果皮果肉挥发性物质的含量和种类，其差异物质在主要有E-2-己烯醛、己醛、乙酸己酯等。张敏将富士苹果和寒富苹果分别贮藏10 个月和12 个月，发现随着贮藏时间的增加，其货架期挥发性化合物不断减少，尤其是寒富苹果的酯类物质。

2.3 正丁醇处理对‘粉红女士’苹果气味活性值的影响

气味活性值（odor activity value，OAV）是鉴别气味活性化合物的一种常用的方法，由物质的含量与其香气阈值的比值决定；当OAV≥1 时可认为该物质对整体香气有贡献作用，并且这个值越大，对整体香气的贡献越大。‘粉红女士’苹果各处理整个贮藏期间的OAV 见表2，共检测出19 种气味活性化合物，主要是酯类、醛类物质，如己醛、（E）-2 己烯醛、壬醛，乙酸己酯、2-甲基丙酸己酯、2-甲基丁酸己酯、2-甲基丁酸乙酯、己酸己酯、辛酸己酯。在包括不同处理的整个贮藏时期，乙酸己酯的气味活性值占到了全部物质的40%～53%，是‘粉红女士’苹果主要的呈香物质。包括乙酸己酯在内的许多C6 酯类已被证实对许多苹果品种（如‘McIntosh’和‘Cortland’）的香气有重要作用。果实的香气不仅仅依靠某一种，或某几种芳香活性化合物，还有化合物之间相互作用的影响。

表2 ‘粉红女士’苹果贮藏期间OAV 活性值Table 2 OAV activity of 'Pink Lady' apple during storage

正丁醇的添加明显增加了贮藏前期乙酸丁酯、丁酸丁酯、2-甲基丁酸丁酯、己酸丁酯的OAV，并且从对照组到10 以及25 μL·L正丁醇处理组的OAV是递增的。在整个贮藏期间，大部分醛类随着贮藏时间的增加，OAV 不断减小，而酯类物质随着贮藏时间的增加，OAV 不断增加，说明在贮藏初期醛类是主要的呈香物质，随着贮藏时间的延长，酯类物质尤其是己酯类物质成了主要的呈香物质。这种现象的产生可能是由于不同挥发性化合物气味阈值以及含量的不同导致的。其中酯类物质的产量通常是随着乙烯的释放而逐渐升高，在果实成熟过程中还伴随着各种香气合成相关酶含量和活性的变化，它们也在影响着挥发性物质的种类和产量。

3 结论

‘粉红女士’苹果果实的挥发性物质主要为酯类和醛类物质，具有甜香果香的乙酸己酯是其特征香气物质。挥发性物质种类和含量在贮藏期间均发生了变化，在贮藏前期和后期种类差异较大的挥发性物质有法尼醇、2-甲基丁酸；含量差异较大的物质有丁酸丙酯、己酸己酯、辛酸己酯和己醛。正丁醇作为苹果果实中挥发性酯类物质合成主要前体物质，采用10 和25 μL·L正丁醇处理均刺激了贮藏初期果实挥发性物质的产生，且25 μL·L正丁醇处理后对贮藏初期挥发性物质含量和OAV 的影响更显著。该研究为后续酯类物质的深入研究奠定了理论基础。