邢冰琪，李 玥，李 娟*

（1.山东省立第三医院药学部，济南 250031；2.泰安市中心医院，山东 泰安 271000）

中药配伍理论是中医药理论的精华之一，开展方剂配伍规律的现代研究对于继承和发展中药配伍理论具有重要理论意义,同时也为更有效地指导临床和中药新产品研制提供依据[1-4]。心律失常是临床上主要心血管疾病之一，研究表明黄连、苦参均对心血管疾病疗效显著，黄连解毒汤及其配伍成分在临床上已用于高血压病、心绞痛的治疗，苦参碱可以从多个方面作用于心血管系统，具有抗心律失常、抗慢性心功能不全、保护心肌缺血、抗心肌细胞纤维化等作用。本文旨在探讨不同配伍苦参与黄连联用的生物碱成分的变化及抗心律失常的作用，为临床应用苦参和黄连提供更多的实验依据。

本实验通过考察不同比例黄连-苦参水煎液“共有峰”的影响，为研究黄连与苦参的药效物质基础成分变化提供可行手段。本文旨在建立黄连、苦参的HPLC 指纹图谱测定方法。利用指纹图谱分析软件，分析黄连、苦参水煎液7 个不同比例配伍后样品间的内在差异。为临床辨证用药，方剂审因增减提供依据，也为制定复方的质量标准提供参考。

1 仪器与试药

1.1 仪器 Agilent1260 高效液相色谱仪、AE200 电子天平（上海梅特勒-托利多仪器有限公司），KDM可调控温电热套（山东鄄城华鲁电热有限公司），SK5200H超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司），AB135-S 电子分析天平，HH 恒温水浴锅，876-1 型真空干燥箱（南通科学仪器厂），SENCOR-205 旋转蒸发仪（上海申顺生物科技有限公司）。

1.2 试药 盐酸小檗碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110713-100911）、苦参碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110805-201117）、氧化苦参碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110780-201007）、药根碱对照品（上海源叶科技有限公司，批号：20111109）、槐定碱对照品（中国药品生物制品检定所，批号：110784-200303）、盐酸巴马汀对照品（北京恒元启天化工技术研究院、北京世纪奥科生物技术有限公司联合研制，批号：MUST-11122703）、甲醇（TEDLA，MS1922-001,LOT:13065034）、乙腈（TEDLA,AS1122-001,LOT:13075017）、磷酸（色谱纯，天津市科密欧化学试剂有限公司，批号：2012120）、超纯水（液相用）、去离子水（提取用）、其它试剂为分析纯，黄连（批号：130308）、苦参（批号：130321）药材购自于山东中医药大学附属医院，；经山东中医药大学附属医院教授张学顺鉴定，黄连为毛茛科植物黄连Coptis chinensisFranch 干燥根茎。苦参为豆科植物苦参Sophora flavescensAit.的干燥根。

2 方法与结果

2.1 溶液的制备

2.1.1 对照品溶液的制备 精密称取盐酸小檗碱对照品适量，加甲醇制成0.603 mg/mL 的溶液，作为对照品溶液。取苦参碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含0.553 mg 的溶液，作为对照品溶液。取氧化苦参碱对照品适量，精密称定，加甲醇制成每1 mL 含0.550 mg 的溶液，作为对照品溶液。

2.1.2 供试品溶液的制备 将不同比例配伍的样品分别置于圆底烧瓶中，加12 倍量水回流提取，提取3 次，每次提取2 h，合并3 次提取液，滤过，滤液浓缩并定容至50 mL，作为浓储液，取1 mL 加水定容至10 mL容量瓶，作为供试品溶液。

2.2 高效液相色谱法色谱条件的筛选

2.2.1 流动相的确定 为了考察并优化高效液相色谱条件，本实验选取了4 组流动相系统：乙腈:纯水、乙腈:0.1%磷酸水溶液、甲醇:纯水、甲醇:0.1%磷酸水溶液，各流动相系统的色谱图如下，由色谱图结果可知：以乙腈:0.1%磷酸水溶液的流动相系统进行梯度洗脱，色谱图的主要色谱峰保留时间适中，分离度良好，因此选择乙腈:0.1%磷酸水溶液的流动相系统进行梯度洗脱[5-7]，见表1。

表1 流动相梯度洗脱条件

2.2.2 检测波长的选择 取同一配伍（黄连：苦参1:1）供试品溶液进行试验，分别测定供试品溶液在210 nm、220 nm、265 nm、345 nm 下的色谱图，每次进样20 μL，结果表明：样品在220 nm 检测波长下，各色谱峰保留时间适中，分离度良好，基线平整且色谱图包含信息量较大，故选取220 nm 为高效液指纹图谱的检测波长[8-10]。

2.3 方法学考察

2.3.1 精密度试验 取同一对照品溶液进行试验，每次进样20 μL，连续进样6 次，测定各共有峰的相对峰面积和相对保留时间，计算得RSD 均＜3%，表明仪器精密度良好。利用SPSS 软件进行指纹图谱相似度分析，相似度均＞0.9。

2.3.2 稳定性试验 取同一配伍（黄连:苦参=1:1）供试品溶液进行试验，每次进样20 μL，每隔2 h 分别进样2 次，测定各共有峰的相对峰面积和相对保留时间，计算得RSD 均＜3%。表明样品在12 h 内稳定，利用SPSS 软件进行指纹图谱相似度分析，相似度均＞0.9。

2.3.3 重复性试验 取同一配伍（黄连:苦参=1:1）制备6 份供试品溶液，进样2 次，每次进20 μL，测定各共有峰的相对峰面积和相对保留时间，计算得RSD均＜3%。表明样品重复性符合要求，利用SPSS 软件进行指纹图谱相似度分析，相似度均＞0.9。

2.4 指纹图谱测定 分别精密吸取不同配伍的黄连、苦参合煎液和分煎混合液各20 μL，注入高效液相色谱仪，按优选的指纹图谱梯度进行洗脱，记录90 min 的高效液相色谱图（见图1）和各色谱图的峰面积、保留时间，结果见表2，表3。

图1 不同比例配伍的供试品溶液指纹图谱

表2 共有峰的相对峰面积

表3 共有峰的保留时间

2.4.1 共有峰面积 计算各样品中的共有峰峰面积，求得各共有峰峰面积占总峰面积的百分比。见表4。

表4 共有峰面积的百分比

2.4.2 相似度计算 利用SPSS 软件进行指纹图谱相似度分析，相似度均＞0.9。见表5。

表5 相似度计算结果

2.4.3 共有峰的确定 比较不同比例配伍的黄连、苦参药对的指纹图谱，采用中药色谱指纹图谱相似度评价系统综合分析最终确定以下18 个峰为指纹图谱的共有峰（见图2），其中峰7、8、9、10、11、12、13、14、15 来自于黄连，其余峰来自于苦参。因各比例中黄连为定量，分析各配伍比例来自黄连的共有峰的峰面积，得7、9、10、15 号共有峰的峰面积随配伍比例的改变变化不大，14 号峰随配伍比例的改变各共有峰峰面积有显著性差异。将苦参取样量转换为3 g，分析得苦参中各共有峰峰面积受配伍比例的改变影响较大。

图2 指纹图谱共有峰

2.4.4 各共有峰的归属 将各对照品溶液按指纹图谱梯度洗脱条件进样，得2 号峰为槐定碱，3 号峰为苦参碱，4 号峰为氧化苦参碱，12 号峰为药根碱，13 号峰为巴马汀，14 号峰为盐酸小檗碱。

3 讨论

实验建立了黄连-苦参的HPLC 指纹图谱测定方法，利用指纹图谱分析软件，分析黄连-苦参水煎液7个不同比例配伍后样品间的差异，来自黄连的7、9、10、15 号共有峰的峰面积随配伍比例的改变变化不大，而14 号峰盐酸小檗碱峰面积随配伍比例改变有显著性差异，来自苦参中的苦参碱、氧化苦参碱各共有峰峰面积受配伍比例的改变影响较大。本研究通过建立黄连-苦参药对的HPLC 指纹图谱，确定了15 个共有峰，并通过主要生物碱的含量测定分析出黄连-苦参的配伍变化的规律，能够对该药对的质量控制以及临床使用提供参考。

综上，本研究建立的黄连-苦参药对的HPLC 指纹图谱测定方法稳定可靠，确定了15 个共有峰，能够对该药对的质量控制以及临床使用提供参考。