赵 燕 谭 洪 李会芳 吕琼花 杜思成 杨秋萍▲

1.昆明医科大学第一附属医院糖尿病科，云南昆明 650032；2.昆明医科大学第一附属医院老年医学科，云南昆明 650032

随着物质生活的不断改善，糖尿病已成为影响人类健康的主要疾病之一，其发展趋势每年都在增加，已成为全球公共卫生问题。根据国际糖尿病联合会（International Diabetes Federation，IDF），到2025年，全世界将有大约3 亿人患糖尿病，糖尿病是一种慢性疾病，治疗周期长，而亚洲是迅速出现的2 型糖尿病（type 2 diabetic mellitus，T2DM）全球流行病的主要地区。2015—2017年对慢性病和风险因素的监测显示，18 岁及以上人口中糖尿病的发病率由2013年的10.4%上升至11.2%。且肥胖、超重人群患病率显著增加，肥胖人群糖尿病患病率升高了2 倍，体重指数≥30 者患病率为21.2%。非酒精性脂肪肝病（nonalcoholic fatty liver disease，NAFLD）和T2DM 的发病风险因素较高，NAFLD 与代谢综合征的成具有双重关联，它增加了T2DM 及其并发症的发生风险，肥胖和糖代谢异常使NAFLD 患者的肝病死亡率增加了10 倍。因此，为2 型糖尿病大鼠建立NAFLD 模型对于结合NAFLD 深入研究T2DM 非常重要。

1 对象与方法

1.1 实验动物

昆明种健康雄性SD 大鼠40 只，由昆明医科大学动物实验中心提供，6～8 周龄，体重（200±24）g，SPF级，动物生产许可证号：SCXK 滇2011-0004，自由供应食物和饮用水。本研究经昆明医科大学动物实验伦理委员会审核通过。

1.2 饲料及试剂

普通饲料：由玉米粉、小麦粉、豆粉、鱼粉、鼓皮巧、骨粉等充分混合、压制成型、喂养（由昆明医科大学动物实验中心提供加工）。基础饲料的总热量为13.85 kJ，其中蛋白质占23%、碳水化合物占50%、脂肪占5%，其他占22%。自制高糖高脂饲料：10%猪油、20%蔗糖、2%胆固醇、1%胆酸钠、67%普通饲料（参照Guo 等的配方），由专业的人员加工生产，各种配料经过充分搅拌、压制和成型后，再进行喂养，每周临时配制。试剂：链脲佐菌素（streptozotocin，STZ）购自calbiochem 公司。

1.3 STZ 液配置

将STZ 300 mg 溶于30 ml 柠檬酸-柠檬酸钠缓冲液（0.1 mmol/L，pH=4.3）中配制成STZ 液（浓度：10 mg/ml），现场配制，尽量避光，并在15 min 内使用。

1.4 模型的建立和分组

40 只SD 大鼠，适应性喂养1 周后按随机数字表法分为糖尿病（diabetes mellitus，DM）组和正常对照（normal control，NC）组，每组各20 只。NC 组给予普通饲料喂养5 周后禁食12 h，DM 组一次性左下腹腔注射STZ 35 mg/kg。STZ 腹腔注射后72 h 测大鼠随机血糖≥16.7 mmol/L（尾静脉血）为造模成功。DM 组共13只造模成功，另从NC 组中选取13 只进行数据统计，继续喂养4 周，每周记录其体重、血糖，喂养过程中DM 组死亡4 只。

1.5 观察指标及评价标准

1.5.1 生化指标检测 腹膜内注射3%戊巴比妥钠麻醉大鼠，从心房取血，以3500 r/min 离心15 min，离心半径为20 cm，取血清并置于无菌的电生理试管中并标记。OlympasAU2700 全自动生化分析仪检测三酰甘油（triacylglyceride，TG）、总胆固醇（total cholesterol，TC）、丙氨酸转氨酶（alanine aminotransferase，ALT）、天冬氨酸转氨酶（aspartate transaminase，AST）。

1.5.2 胰岛素抵抗指数 酶联免疫吸附法用于检测空腹胰岛素（fasting insulin，FINS）。通过稳态模式评估胰岛素抵抗指数（Homeostasismodel assessment insulin resistance index，HOMA-IR）=FINS×空腹血糖（fasting blood glucose，FPG）/22.5。胰岛 素敏感 指数（insulin sensitivity index，ISI）=1/（FINS×FPG）。

1.5.3 肝脏标本留取 大鼠麻醉取血后解剖取肝脏，天平称重，计算肝指数=肝重/体重×100%。部分放入10%福尔马林固定石蜡包埋，切片，HE 染色，光镜下观察。

1.5.4 HE 染色NAS 积分结果判断 每张切片随机选取5 个视野，进行图像的采集。NAFLD 活动的常规积分是根据NAFLD 诊断和治疗手册（修订本）中规定的组织学诊断标准进行的（表1）。非酒精性脂肪肝病活动度积分（non-alcoholic fatty liver disease srore，NAS）＜3 分可排除非酒精性脂肪性肝炎（nonalcoholic steatohepatitis，NASH），NAS ＞4 分则可诊 断NASH，NAS 3～4 分为NASH 可能。

表1 NAS 积分（分）

1.6 统计学方法

2 结果

2.1 两组大鼠造模成功后血糖及体重的比较

造模成功6、7、8、9、10 周后，DM 组的体重低于NC 组，血糖高于NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表2～3）。

表2 两组大鼠造模成功后血糖的比较（mmol/L，±s）

表3 两组大鼠造模成功后体重的比较（g，±s）

2.2 两组大鼠血脂及肝指数的比较

DM 组的TG、TC、ALT、肝指数高于NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05）；两组的AST 比较，差异无统计学意义（P＞0.05）（表4）。

表4 两组大鼠血脂及肝指数的比较（±s）

2.3 两组大鼠造模成功6、10 周后FINS、ISI、HOMA-IR的比较

造模成功6、10 周后，DM 组的FINS、HOMA-IR高于NC 组，ISI 低于NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05）（表5）。

表5 两组大鼠造模成功6、10 周后FIS、ISI、HOMA-IR 的比较（±s）

2.4 两组大鼠肝组织切片HE 染色结果及NAS 积分的比较

NC 组大鼠肝小叶形态规则，肝细胞排列整齐中央细胞核大而圆，细胞质均匀，无脂肪变性和炎症细胞侵袭。DM 组大鼠肝细胞水肿、脂肪变性、肝细胞分布不规则、炎性细胞浸润、局部点状、坏死。DM 大鼠的NAS 积分为（4.29±0.95）分，高于NC 组的（0.92±0.64）分且＞4 分，差异有统计学意义（P＜0.01）（图1，封三）。

图1 肝组织HE 染色（400×）（见内文第50页）

3 讨论

NAFLD 包括单纯性脂肪肝、非酒精性脂肪性肝炎、肝硬化和肝细胞癌。是代谢性应激性肝损害，与胰岛素抵抗（insulin resistance，IR）和遗传易感性密切相关。有报道显示全球普通成人NAFLD 患病率为6.3%～45%（中位数25.2%），包括中国在内的亚洲多数国家NAFLD 患病率处于中上水平（＞25%）。T2DM与NAFLD 关系密切，世界上最常见的慢性肝病是NAFLD。研究表明DM 与肝纤维化评分间有显著相关性。近年来，T2DM 的发病率一直在上升，因此构建T2DM 大鼠NAFLD 模型对NAFLD 早期诊治的进一步研究有重要意义。

目前主要有自发性动物模型、动物遗传模型和动物实验模型方法为T2DM 建立NAFLD 模型。然而，前两种方法在科学研究中没有得到广泛应用，原因是成本高、喂养和繁殖条件高、周期长等。本研究大鼠用10%猪油、20%蔗糖等制作的高糖高脂饮食喂养5 周后，腹膜注射小剂量的STZ（35 mg/kg），以建立T2DM的NAFLD 模型。DM 组SD 大鼠的血糖水平显著提高（＞16.7 mmol/L），并逐渐出现“三多”（多尿、多食、多饮）症状和体重减轻。血糖、血脂、ALT 升高，提示造模成功且出现血脂、肝功能异常。本研究结果显示，造模成功6、10 周后，DM 组大鼠的FIS、HOMA-IR 高于NC 组，ISI 低于NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05），与T2DM 合并NAFLD 的临床特征一致。胰岛素抵抗既是T2DM 的发病机制，也是NAFLD 的主要发病机制，T2DM 和NAFLD 在发病机制上存在“共同土壤”，且T2DM 是NAFLD 患者疾病进展的危险因素。国内外指南均指出需高度警惕T2DM 患者可能存在NAFLD 和NASH。并且在治疗中也提出不管患者有无T2DM，胰岛素增敏剂吡咯列酮都可以用来治疗肝活检证实的NASH 患者。

本研究建立的T2DM 合并NAFLD 模型具有胰岛素抵抗及血脂、肝功能异常。肝组织HE 染色光镜下观察可见DM 组大鼠肝细胞破坏，细胞位置不规则，有脂肪变性和炎症细胞浸润，部分见点状、局部坏死；NS 组大鼠肝叶形态规律，细胞排列整齐，细胞质均匀，无脂肪变性和炎症细胞侵袭。本研究结果还显示，DM 组的NAS 积分高于NC 组，差异有统计学意义（P＜0.05），提示T2DM 大鼠已经有脂肪肝或脂肪肝炎的病理特征。

综上所述，本研究采用高糖高脂饲料喂养大鼠5 周联合小剂量STZ 腹腔内注射能成功诱导建立T2DM 合并NAFLD 大鼠模型，为T2DM 合并NAFLD进一步研究奠定基础。