李福荣，吕晓彤，闫昕，李汶轩，刘治国，张翠英

（省部共建食品营养与安全国家重点实验室，工业发酵微生物教育部重点实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457）

粟酒裂殖酵母（Schizosaccharomyces pombe）在葡萄酒发酵过程中具有明显的降苹果酸[1]、降葡萄糖酸[2]和增加丙酮酸[3]的能力，能有效改善葡萄酒口感[4]、增强葡萄酒色泽稳定性[5]，同时还能有效控制氨基甲酸乙酯、生物胺和曲霉毒素A[6]的含量，以确保葡萄酒的安全性[7]。最重要的是粟酒裂殖酵母具备与酿酒酵母不相上下的酒精发酵能力[8]，且在高酒精度、高渗透压和高SO2等[2，9-10]极端环境中具有良好的耐受性。然而使用粟酒裂殖酵母发酵葡萄酒的同时会产生影响葡萄酒质量的代谢产物，如过量的乙酸、硫化氢、乙醛、乙酰丁香和乙酸乙酯等[10-13]。至今为止，全世界仅有一株粟酒裂殖酵母符合直接酿造优质葡萄酒的条件，但发酵工艺复杂、成本高[14]，因此并没有在葡萄酒发酵工业中得到广泛使用。目前为了将粟酒裂殖酵母应用在葡萄酒发酵中，很多研究者尝试从优良性能菌株的筛选[10]、多菌种混合发酵[15]、原生质体融合及基因克隆表达相关酶等方向进行研究[16-18]。

本试验通过优选粟酒裂殖酵母发酵玫瑰香葡萄酒的最适发酵温度和最适接菌量，然后用16株粟酒裂殖酵母对玫瑰香葡萄进行单独发酵，通过对发酵速率、有机酸含量、主要挥发性物质和颜色等理化指标进行测定和比较分析，旨在优选出用于发酵玫瑰香葡萄酒效果最佳的粟酒裂殖酵母菌株。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

玫瑰香葡萄：2021年8月采自河北省秦皇岛，含糖量为200 g/L（以还原糖计）、pH值为3.4、苹果酸含量为9.07 g/L。

酒石酸饱和溶液：在500 mL烧杯中加入250 g未潮解的酒石酸晶体和150 mL蒸馏水，用微火加热，不断搅拌，使其完全溶解。

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose medium，YEPD）：葡萄糖2%、蛋白胨2%、酵母浸粉1%，115℃条件下灭菌20 min；生理盐水：0.9%氯化钠，115℃条件下灭菌20 min。

粟酒裂殖酵母（Sp-4、Sp-7、Sp-12、Sp-13、Sp-14、Sp-19、Sp-20、Sp-64、Sp-65、Sp-410、Sp-412、Sp-413、Sp-414、Sp-417、Sp-419、Sp-420）和葡萄汁酵母（Saccharomyces uvarum）WY-1：天津科技大学天津工业微生物重点实验室保存。

1.2 仪器与设备

MS204S电子天平：梅特勒-托利多仪器（上海）有限公司；LDZM-60KCS立式压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器械厂；SPX-250B-Z生化培养箱：上海博迅实业有限公司；Agilent 7890A气相色谱仪、Agilent 1260高效液相色谱仪：美国Agilent公司。

1.3 方法

1.3.1 样品处理

将玫瑰香葡萄分选、除杂、去梗、破碎后装瓶，60℃灭菌30 min，待温度降至28℃，加入50 mg/L～100 mg/L SO2（根据葡萄损坏程度改变用量），置于4℃冰箱静置12 h左右，发酵前使用饱和酒石酸溶液将葡萄汁的pH值调至3.4。

1.3.2 试验方法

1.3.2.1 菌种扩大培养

酵母的一级种子培养液：挑取一环酵母接种于装有5 mL YEPD三角瓶中，30℃、180 r/min培养12 h；

酵母的二级种子培养液：将5 mL一级种子接入到装有45 mL YPED的三角瓶中，30℃、180 r/min离心至细胞浓度为1×108CFU/mL。

1.3.2.2 发酵工艺

提前将准备好的葡萄汁分装于250 mL广口三角瓶中，装液量为190 mL备用。

将培养好的种子液用无菌生理盐水离心（6 000 r/min、3 min）洗涤2次，备用。

1）将粟酒裂殖酵母以5×106CFU/mL的接菌量接种于葡萄汁中，摇匀后，分别置于23、25、28℃培养箱中静置发酵，直至发酵结束（24h的平均失重小于0.2g）。

2）将粟酒裂殖酵母分别以 1×106、5×106、1×107CFU/mL的接种量接种于葡萄汁中，摇匀后，置于25℃培养箱中静置发酵，直至发酵结束（24h的平均失重小于0.2g）。

3）将 16 株粟酒裂殖酵母菌液（Sp-4、Sp-7、Sp-12、Sp-13、Sp-14、Sp-19、Sp-20、Sp-64、Sp-65、Sp-410、Sp-412、Sp-413、Sp-414、Sp-417、Sp-419、Sp-420）和对照组葡萄汁酵母（WY-1）（接菌量为 5×106CFU/mL）接种于葡萄汁中摇匀后，置于25℃恒温培养箱中静置发酵，直至发酵结束（24 h的平均失重小于0.2 g）。

每组发酵试验重复3次。每隔12h称重并取样1次，直至发酵结束。

1.3.3 分析检测

1.3.3.1 发酵速率的测定

根据GB 15037—2006《葡萄酒》测定菌株的发酵速率。

1.3.3.2 葡萄酒颜色的测定

准确吸取葡萄酒发酵液1 mL，用蒸馏水定容至10 mL容量瓶中，取稀释后的酒样于1 cm光程比色皿中，分别在 420、520、620 nm 下测定吸光度[19]，色度值计算公式如下。

1.3.3.3 有机酸的测定

运用高效液相色谱法测定有机酸含量[10]。葡萄酒发酵液经0.22 μm纤维滤膜过滤后采用高效液相色谱仪测定。试验条件：色谱柱为Bio-Rad Aminex-HPX 87H，检测器为紫外检测器，波长为210 nm，流动相为5 mmol/L H2SO4，流速为 0.5 mL/min，柱温为 35 ℃，进样量为20 μL。根据标品出峰时间和标准曲线信息，计算出发酵样品中有机酸含量。

1.3.3.4 主要风味物质的测定

根据GB 15037—2006《葡萄酒》中气相色谱法测定样品中的主要风味物质。葡萄酒发酵液经蒸馏后采用气相色谱法测定：自动进样器为Agilent G4512A，色谱柱为Agilent HP-INNOW A X（30 m×0.32 mm×0.5 μm），检测器为火焰离子化检查器；进样口温度200℃，检测器温度恒定150℃。升温条件：起始柱温度50℃保持8 min，以5℃/min升至150℃保温15 min，分流进样。测试条件：进样量 1 μL，分流比为 10∶1，流速0.8 mL/min，载气为高纯氮气。

1.3.3.5 指标测定

根据GB 15037—2006《葡萄酒》中的高效液相色谱法测定葡萄酒中的重要指标。葡萄酒发酵液经0.22μm纤维滤膜过滤后采用液相色谱仪测定。色谱柱为Sil green GH0830078H（300 mm×7.8 mm×9 μm）；检测器为示差折光检测器；流动相为5 mmol/L H2SO4，流速为0.6 mL/min；检测器温度为45℃，柱温为65℃，进样量为20 μL，根据标品出峰时间和标准曲线信息，计算出发酵样品中葡萄糖、果糖、乙醇和甘油的含量。

1.4 数据处理

各项理化指标进行3次平行取样。数据以平均值±标准差表示，P＜0.05表示差异有显著性；并使用Origin 8.5和Excel分别进行图和表的绘制。

2 结果与分析

2.1 发酵温度和接菌量的优选

2.1.1 发酵温度与接菌量对降苹果酸能力的影响

苹果酸含量过高会使葡萄酒带有一种尖锐的酸味。传统的葡萄酒发酵，通过苹果酸-乳酸发酵来降解苹果酸，以解决葡萄酒中苹果酸过量的问题[20]。粟酒裂殖酵母同样具备高效降解苹果酸的能力，但不同发酵温度和不同接菌量会对粟酒裂殖酵母的降解苹果酸能力产生一定影响。不同发酵温度和不同接菌量的苹果酸降解能力见表1。

表1 不同发酵条件苹果酸的降解能力Table 1 Degradation ability of malic acid under different fermentation conditions

由表1可知，发酵温度为23、25、28℃时，苹果酸降解率分别为89.21%、96.81%、96.36%。发酵温度为25℃时，对苹果酸的降解能力较高。而接菌量为1×106、5×106、1×107CFU/mL 时，苹果酸的降解率分别为84.80%、96.81%、96.15%。接菌量为5×106CFU/mL时，对苹果酸的降解能力较高。由此可见，当接菌量为5×106CFU/mL、发酵温度为25℃时，具有有效降解苹果酸的能力。

2.1.2 发酵温度与接菌量对发酵速率和残糖含量的影响

在葡萄酒发酵过程中，主体菌株发酵速度越慢，感染其他菌株的风险就越大。因此，较快的发酵速度至关重要。不同发酵温度与不同接菌量下CO2释放量以及残糖含量见图1。

图1 不同发酵条件下CO2释放量和残糖含量Fig.1 CO2release and residual sugar content under different fermentation conditions

由图1可知，当发酵温度为23℃时葡萄酒的发酵速度最慢，28℃时发酵速度最快，25℃时发酵速度适中，且与28℃时的发酵速率相近。通过对比不同接菌量发现，当接菌量为1×106CFU/mL时，葡萄酒的发酵速度最慢，接菌量为1×107CFU/mL时发酵速度最快，接菌量为5×106CFU/mL时，发酵速度适中，且与接菌量为1×107CFU/mL时的发酵速率相近（图1a）。当发酵温度为25℃、接菌量为5×106CFU/mL时，粟酒裂殖酵母对残糖的消耗能力与发酵速度最快的发酵温度和接菌量持平（图1b）。综上所述，当发酵温度为25℃、接菌量为5×106CFU/mL时，既能充分发酵葡萄酒中的糖，又处于较快的发酵速率。

2.1.3 发酵温度与接菌量对葡萄酒中酯类物质的影响

乙酸乙酯过量会令葡萄酒充斥着指甲油的味道[20]，乙酸乙酯含量的多少直接影响葡萄酒的品质。不同发酵温度与不同接菌量下主要酯类物质含量见图2。

图2 不同发酵条件下主要酯类物质含量Fig.2 Content of main esters in wine under different fermentation conditions

由图2可知，当发酵温度为25℃、接菌量为5×106CFU/mL 时，乙酸乙酯含量为（12.2±2.58）mg/L，在葡萄酒中属于正常值[20]。同时，该条件下的乙酸异戊酯含量和乳酸乙酯含量分别为（0.43±0.01）mg/L和（6.26±0.10）mg/L，均在正常范围内（乙酸异戊酯0.1 mg/L～12.0 mg/L，乳酸乙酯 1 mg/L～50 mg/L）[20]。

2.1.4 发酵温度与接菌量对葡萄酒中高级醇含量的影响

高级醇含量过高会令人“上头”，而高级醇含量太低又会使酒体香气寡淡，适当的高级醇含量有利于葡萄酒整体的丰富度。葡萄酒中异戊醇、异丁醇和苯乙醇3种高级醇的含量占总高级醇的92%～96%[20]。不同发酵温度和不同接菌量对葡萄酒中高级醇含量的影响见图3。

图3 主要高级醇类物质的含量Fig.3 Content of main higher alcohols

由图3可知，当发酵温度为28℃时，4种主要高级醇（正丙醇、异丁醇、异戊醇、苯乙醇）的总含量为138.91 mg/L，不在正常范围（140 mg/L～420 mg/L），而当发酵温度为23℃和25℃时，4种高级醇总含量分别为172.62 mg/L和170.85 mg/L均符合筛选范围；接菌量为1×106CFU/mL和1×107CFU/mL时，4种高级醇总含量分别为60.41 mg/L和71.47 mg/L，不在正常范围，而当接菌量在5×106CFU/mL时，4种高级醇总含量（170.85 mg/L）符合筛选范围。因此，发酵温度为23℃和25℃时，4种高级醇含量正常，接菌量在5×106CFU/mL时，高级醇总含量正常。

2.1.5 发酵温度与接菌量对葡萄酒中主要醇类物质的影响

乙醇是葡萄酒中含量最多的醇类物质，甘油是葡萄酒中含量排名第二的醇类物质。其中甘油含量直接影响葡萄酒的口感。在标准范围（5 g/L～14 g/L）内，甘油含量越多，葡萄酒的品质越好。不同接菌量和不同发酵温度下乙醇含量和甘油含量如图4所示。

图4 不同发酵条件最主要的两种醇类物质含量Fig.4 Content of two main alcohols in wine under different fermentation conditions

由图4可知，发酵温度25℃的甘油含量（6.51±0.11）g/L 和乙醇含量（68.36 ±0.33）g/L，与其他发酵温度甘油含量相比处于较好的水平，接菌量为5×106CFU/mL的甘油含量（6.51±0.11）g/L和乙醇含量（68.36±0.33）g/L与其他接菌量相比也处于较好的水平。

综上所述，对于粟酒裂殖酵母菌株发酵玫瑰香葡萄酒的最适发酵温度为25℃，最适接菌量为5×106CFU/mL。

2.2 16株粟酒裂殖酵母的优选

2.2.1 苹果酸含量的对比

葡萄酒中的苹果酸含量仍是优选粟酒裂殖酵母菌株的重要因素之一。该试验对16株粟酒裂殖酵母进行单独发酵，优选苹果酸降解能力最强的粟酒裂殖酵母。葡萄汁酵母和16株粟酒裂殖酵母的降苹果酸能力见图5。

图5 葡萄汁酵母与粟酒裂殖酵母发酵玫瑰香葡萄酒中苹果酸的含量Fig.5 Content of malic acid in wine fermented by S.uvarum and S.pombe

由图5可知，粟酒裂殖酵母Sp-410菌株发酵玫瑰香葡萄酒的苹果酸含量为0.18 g/L，且粟酒裂殖酵母Sp-410菌株对玫瑰香葡萄酒中苹果酸的降解能力显著高于其他粟酒裂殖酵母，降解率达到97.98%。由此可见，Sp-410菌株是16株粟酒裂殖酵母中降解苹果酸能力最好的菌株。

2.2.2 发酵速率和残糖含量的对比

16株粟酒裂殖酵母中的发酵速率和残糖含量见图6。

图6 葡萄汁酵母与粟酒裂殖酵母发酵玫瑰香葡萄酒中的发酵速率和残糖含量Fig.6 Fermentation rates and residual sugar content in wine fermented by S.uvarum and S.pombe

由图6可知，通过对比发酵过程中CO2释放量发现，当发酵时间超过12 h后，粟酒裂殖酵母Sp-410的CO2释放量占总释放量的10.53%，相较于其他14株粟酒裂殖酵母，Sp-410菌株的发酵启动速度最快（图6a）。通过对比发酵结束后葡萄酒中的残糖含量发现，Sp-410菌株能够充分发酵葡萄汁中的糖（图6b）。

2.2.3 乙酸及乙酸的代谢产物含量对比

粟酒裂殖酵母菌发酵葡萄酒的过程中，随着苹果酸的降低，乙酸、乙酸乙酯、乙醛的含量开始增高。正常葡萄酒中乙酸的含量为0.1 g/L～0.6 g/L，超出该范围越多，葡萄酒闻起来越刺鼻；乙醛含量超过125 mg/L时，会有青苹果和鲜切草的味道，对葡萄酒的香气造成严重的负面影响；正常葡萄酒中的乙酸乙酯的含量范围为5 mg/L～200 mg/L，乙酸乙酯过量会令葡萄酒充斥着一股指甲油味[10]。粟酒裂殖酵母发酵玫瑰香葡萄酒的乙酸及其代谢产物的含量见图7。

图7 葡萄汁酵母与粟酒裂殖酵母发酵玫瑰香葡萄酒中的乙酸、乙醛及乙酸乙酯的含量Fig.7 Content of acetic acid，acetaldehyde，and ethyl acetate in wine fermented by S.uvarum and S.pombe

由图7可知，Sp-410菌株发酵后的乙酸含量[（0.18±0.01）g/L]和乙醛含量[（48.46±1.95）mg/L]明显低于其他15株粟酒裂殖酵母，而乙酸乙酯的含量（5.67±0.73）mg/L处于中等水平。因此，优选出的Sp-410菌株符合乙酸代谢产物的筛选标准。

2.2.4 主要醇类物质含量对比

16株粟酒裂殖酵母菌中的乙醇和甘油含量如图8所示。

图8 葡萄汁酵母与粟酒裂殖酵母发酵玫瑰香葡萄酒中的乙醇和甘油的含量Fig.8 Content of ethanol and glycerin in wine fermented by S.uvarum and S.pombe

由图8可知，粟酒裂殖酵母Sp-410的乙醇含量（52.49±0.15）g/L在16株粟酒裂殖酵母菌中最高（图8a），其甘油含量（4.93±0.03）g/L相较于其他 15株粟酒裂殖酵母菌处于较高的水平（图8b）。

2.2.5 酒体色度值对比

葡萄酒的色度值是评价葡萄酒感官质量的一项重要指标，根据葡萄酒的色度值，能够判断葡萄酒的氧化程度和质量好坏，葡萄酒色度的高低主要由酚类物质花色苷等决定。色度值越高，花色素含量越高，葡萄酒的颜色越深，反之葡萄酒颜色越浅[20]。葡萄汁酵母与16株粟酒裂殖酵母的酒体色度值如图9所示。

图9 葡萄汁酵母与粟酒裂殖酵母发酵玫瑰香葡萄酒中的色度值对比Fig.9 Comparison of chromaticity value of wine fermented by S.uvarum and S.pombe

如图9所示，粟酒裂殖酵母Sp-410的色度值1.26±0.01明显高于其他15株粟酒裂殖酵母的色度值。因此，粟酒裂殖酵母Sp-410菌株酿造的玫瑰香葡萄酒的酒色更深，更符合优选发酵玫瑰香葡萄酒色泽的标准。

3 结论

粟酒裂殖酵母在发酵温度为25℃和接菌量为5×106CFU/mL的条件下，具有有效降解苹果酸的能力，主要酯类物质和醇类物质的含量均处于最佳水平。优选的粟酒裂殖酵母Sp-410单独发酵玫瑰香葡萄酒的各项指标均符合标准，相比于其他15株粟酒裂殖酵母，Sp-410菌株的苹果酸降解率（97.98%）和色度值（1.26）最高，乙酸含量（0.18 g/L）和乙醛含量（48.46 mg/L）较低，乙酸乙酯的含量（5.67 mg/L）和甘油含量（4.93 g/L）均处于较高的水平。因此，粟酒裂殖酵母的最适发酵温度为25℃，最适接菌量为5×106CFU/mL，优选出的粟酒裂殖酵母菌Sp-410为酿造优质玫瑰香葡萄酒的优良菌种。

本试验为使用粟酒裂殖酵母发酵葡萄探索了最适发酵温度和最适接菌量，为酿造优质玫瑰香葡萄酒提供优良菌种。粟酒裂殖酵母的筛选有利于推动粟酒裂殖酵母在葡萄酒发酵的发展，为葡萄酒产业增添新的色彩。