舒聪涵，孙继鹏，王家星，廖妙飞，郑斌，周宇芳*

（1.浙江省海洋开发研究院，浙江 舟山 316021；2.浙江海洋大学，浙江 舟山 316022）

将动物的皮、骨或明胶通过水解降解为小分子肽段，当其单条肽链的组成在两个氨基酸以上且分子量小于10 kDa时，可以称为胶原肽[1]，胶原肽由胶原衍生而来，也称为水解胶原。研究表明，摄入某些胶原水解物具有促进健康的作用，其除了拥有胶原所有性质外，还具有多种生物活性[2]，如降血压、抑菌、抗肿瘤等[3-6]。此外，相较于陆生动物胶原蛋白，海洋生物蛋白具有低过敏性、低抗原性等优势[7]。

金枪鱼是一种大洋暖水性高度洄游鱼类，属硬骨鱼纲鲈形目鲭科[8]。作为一种深海鱼类，金枪鱼营养价值高、肉质鲜美、无污染，颇受市场欢迎，其加工产业也因此发展迅速。但在加工过程中会伴随着大量副产物的产生，通常被随意丢弃或是直接加工成低值饲料，既浪费资源又污染环境。金枪鱼鱼骨约占副产物20%[9]，其蛋白含量丰富，约为57.2%[10]，将它作为提取胶原肽的原材料，可以提高金枪鱼骨的利用价值。因此本研究以金枪鱼骨为原料，采用酶解法制备骨胶原肽，以水解度为指标，从5种商用蛋白酶中筛选出最佳蛋白酶，并通过单因素、响应面试验优化酶解工艺，以期为金枪鱼骨附加值的提高提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

黄鳍金枪鱼骨：浙江融创食品工业有限公司；胃蛋白酶（2 000 U/g）：华懋双汇实业公司生物化学制药厂；食用小苏打：河南恩苗食品有限公司；动物蛋白酶（10万 U/g）、骨蛋白酶（10万 U/g）、海产品水解酶（10万 U/g）：南宁东恒华道生物公司；中性蛋白酶（5万U/g）：河南仰韶生化工程有限公司；风味蛋白酶（1.5万U/g～1.7万U/g）：浙江一诺生物科技有限公司；甲醇、乙腈（均为色谱纯）：美国TEDIA公司；氨基酸标准品、邻苯二甲醛、氯甲酸芴甲酯（均为色谱纯）：美国Sigma公司；三乙胺、四氢呋喃、结晶乙酸钠、三氯乙酸、盐酸、氢氧化钠、甲醛（均为分析纯）：国药集团化学试剂有限公司。

1.2 仪器与设备

KDN816凯氏定氮仪：上海纤检仪器有限公司；710401040冷冻干燥机：美国Labconco公司；YSF-20L双层玻璃反应釜：巩义市予华仪器有限公司；CeraMem-0100卷式膜多功能小试设备：厦门世达膜科技有限公司；Agilent 1100高效液相色谱仪：美国安捷伦科技公司。

1.3 方法

1.3.1 金枪鱼骨粉的制备

从-20℃冰箱中取出鱼骨，流水解冻15 min左右，刷子清洗表面后去除多余碎肉，并用剪刀将鱼骨剪成2 cm左右小段；称重后，加入2%胃蛋白酶，调节pH值为3.0，在55℃条件下对无法去除的碎肉酶解3 h；用灭菌锅120℃蒸煮30 min，去除油脂，沥干；添加2%食用小苏打进行脱色，2 h后多次用自来水冲洗至中性；55℃烘箱烘干12 h；将鱼骨用粉碎机粉碎后过20目筛，得到成品鱼骨粉。

1.3.2 筛选最佳水解用酶

称取鱼骨粉10 g，加入100 mL去离子水，分别添加1.0%的动物蛋白酶、中性蛋白酶、风味蛋白酶、骨蛋白酶和海产品水解酶，酶解条件见表1。酶解结束后沸水浴灭酶15 min，离心取上清液测水解度。通过比较水解度的高低，选择酶解效果最佳的蛋白酶。

表1 不同蛋白酶的酶解条件Table 1 Enzymatic hydrolysis conditions of different proteases

酶解液中的游离氨基酸态氮含量采用甲醛滴定法测定[11]。原料中总氮含量采用GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中的凯氏定氮法测定，取3次平行测量的平均值。用下列公式计算水解度。

1.3.3 酶解条件单因素试验

选择1.3.2筛选出的水解度最佳的酶对金枪鱼骨进行酶解，固定温度50℃、自然pH值、时间6 h、料液比 0.10∶1（g/mL），考察不同酶添加量（0.5%、1.0%、2.0%、3.0%）对水解度的影响；固定酶添加量、温度50 ℃、自然 pH 值、料液比0.10∶1（g/mL），考察不同酶解时间（2、4、6、8、10 h）对水解度的影响；固定酶解时间、酶添加量、温度50℃、自然pH值，考察不同料液比[0.04 ∶1、0.06 ∶1、0.08 ∶1、0.10 ∶1、0.12 ∶1（g/mL）]对水解度的影响；固定料液比、酶解时间、酶添加量、自然pH 值，考察不同温度（40、45、50、55、60 ℃）对水解度的影响；固定酶解温度、料液比、酶解时间和酶添加量，考察不同 pH 值（6.5、7.0、7.5、8.0、8.5）对水解度的影响。

1.3.4 酶解条件响应面优化

在单因素试验基础上，根据Box-Behnken组合试验设计原理，考察酶添加量（A）、酶解时间（B）、料液比（C）、温度（D）、pH值（E）这5个因素对水解度的影响，各取3个水平进行响应面试验，试验因素水平见表2。

表2 金枪鱼骨酶解工艺的响应面因素和水平Table 2 Response surface factors and levels of enzymatic hydrolysis of tuna bone

1.3.5 金枪鱼骨胶原肽的游离氨基酸组成测定

在反应釜中对金枪鱼骨进行酶解，酶解条件为1.3.4优化得到的最优工艺，酶解结束后90℃灭酶0.5 h，离心弃沉淀，上清液即为金枪鱼骨胶原肽酶解液。将酶解液过卷式膜多功能小试设备进行分子量分级，得到不同分子级的金枪鱼骨胶原肽。

用三氯乙酸沉淀不同分子级的金枪鱼骨胶原肽后，分别以邻苯二甲醛和氯甲酸芴甲酯作为一级和二级氨基酸的衍生反应试剂，参考GB/T 22729—2008《海洋鱼低聚肽粉》中的柱前自动衍生化反相高效液相色谱法测定骨胶原肽中的游离氨基酸总量。

1.3.6 数据统计分析

试验数据以平均值±标准差表示，单因素试验利用Excel软件进行分析，利用Origin 8.0软件进行绘图，响应面试验利用Design Expert 8.0软件进行分析。

2 结果与分析

2.1 最佳酶筛选结果

5种蛋白酶的水解度比较结果见图1。

图1 5种蛋白酶的水解度比较Fig.1 Comparison of hydrolysis degrees of five proteases

水解度高代表更多的底物被蛋白酶水解，由图1可知，水解度由高到低依次为动物蛋白酶、海产品蛋白酶、骨蛋白酶、风味蛋白酶，最后是中性蛋白酶。与海产品蛋白酶相比，动物蛋白酶水解度略高，但无显著性（p＞0.05），与其他蛋白酶相比差异明显。蛋白酶根据作用位点不同，分为内肽酶和端肽酶。内肽酶能从中间切断大分子量多肽链，形成小分子量多肽；端肽酶能从多肽的游离羧基末端或氨基末端逐个水解肽链生成氨基酸[12]。动物蛋白酶本身是一种由内肽酶和端肽酶组成的复合酶，具有多种酶切位点，故其水解度较高。柏昌旺等[13]以水解度、短肽质量浓度及得率为指标对牡蛎进行水解，从5种蛋白酶中筛选出效果较好的酶是动物蛋白酶，与本研究所得结论相似。因此，本试验选取动物蛋白酶进行后续试验。

2.2 单因素试验结果

2.2.1 酶添加量对水解度的影响

酶添加量对水解度的影响见图2。

图2 酶添加量对水解度的影响Fig.2 The efect of enzyme addition on degree of hydrolysis

如图2所示，当酶添加量从0.5%到2.0%时，水解度逐渐增加，在2.0%时水解度达到最高。当酶添加量从2.0%继续增加到3.0%时，水解度则呈现略微下降的趋势。酶添加量的多少意味着酶活性的大小，当底物浓度一定时，随着酶添加量的增加，水解度与其成正比。但当酶添加量过多时，则会导致底物与酶的结合位点不断减少，即便再添加酶，水解度也不会有较大提高，还会造成浪费[14]。故2.0%为最适加酶量。

2.2.2 酶解时间对水解度的影响

酶解时间对水解度的影响见图3。

图3 酶解时间对水解度的影响Fig.3 The effect of enzymolysis time on degree of hydrolysis

如图3所示，当酶解时间从2 h到8 h时，水解度持续升高；当酶解时间从8 h增加到10 h时，金枪鱼骨胶原肽的水解度变化则不大。可以看出，酶解时间越长酶解越彻底，但随着时间的延后，底物不断发生反应，浓度逐渐降低，酶活也达到极限，水解度也趋于稳定[15]。故本试验选取酶解时间为8 h。

2.2.3 料液比对水解度的影响

料液比对水解度的影响见图4。

图4 料液比对水解度的影响Fig.4 The effect of material liquid ratio on degree of hydrolysis

由图4可以看出，当料液比从 0.04∶1（g/mL）到0.08∶1（g/mL）时，水解度升高并在料液比为0.08∶1（g/mL）时达到最大值。当料液比从 0.08∶1（g/mL）到0.12∶1（g/mL）时，水解度则开始逐渐降低。由此可见，当料液比为0.08∶1（g/mL）时，金枪鱼骨胶原肽的水解度最佳。料液比对酶解速率有重要影响，底物浓度过低时，酶与底物结合空间较小，水解程度不高，降低试验效率；底物浓度过高时，蛋白溶液黏度增大，影响酶与底物的充分接触，水解度也会下降[16]。

2.2.4 温度对水解度的影响

温度对水解度的影响见图5。

图5 温度对水解度的影响Fig.5 The effect of temperature on degree of hydrolysis

如图5所示，当酶解温度从40℃升高到55℃时，水解度逐渐增加，当温度为55℃时，水解度达到最大值。当酶解温度从55℃继续升高到60℃时，水解度则开始下降。酶解温度影响着酶的活性，温度的升高有利于提高酶活性，但过高时会导致酶活性减弱甚至丧失，从而影响酶解效果[17]。故本试验选取55℃作为酶解温度。

2.2.5 pH值对水解度的影响

pH值对水解度的影响见图6。

图6 pH值对水解度的影响Fig.6 The effect of pH on degree of hydrolysis

如图6所示，当pH值从6.5到7.0时，水解度逐渐升高并在7.0时达到最大。当pH值从7.0继续增加到8.5时，水解度则持续降低。pH值会通过影响酶的构象和底物的解离状态进而影响水解度[18]。因此，本试验选取酶解pH值为7.0。

2.3 响应面试验结果

在单因素试验结果的基础上，以酶添加量、酶解时间、料液比、温度、pH值这5个因素作为响应变量，水解度作为响应值，用Design Expert 8.0软件Box-Behnken组合试验设计原理进行响应面试验，每个变量均设3个水平，方案与结果如表3所示。

表3 响应面方案设计和试验结果Table 3 Response surface design and experimental results

续表3 响应面方案设计和试验结果Continue table 3 Response surface design and experimental results

对表3结果进行分析，得到金枪鱼骨胶原肽水解度对酶添加量、酶解时间、料液比、温度、pH值5个因素的二次多项回归模型方程，即y=65.55+1.72A+1.29B+1.46C-2.17D+1.00E+0.018AB+0.5AC-1.88AD+0.39AE+0.11BC-0.005 5BD-0.10BE-0.32CD+0.61CE+0.043DE-2.34A2-3.43B2-3.77C2-5.91D2-4.31E2。

方差分析见表4。

表4 回归方程参数方差分析Table 4 Analysis of variance of regression equation parameters

续表4 回归方程参数方差分析Continue table 4 Analysis of variance of regression equation parameters

由表4方差分析可知，模型p值＜0.000 1，拟合度较好。失拟项p值为0.095 6＞0.05，不显著，进一步说明模型不失拟，选择合理。根据文献研究表明，R2＞0.75是模型可被接受的范围[19]，本试验模型的相关系数R2为0.939 9，相对可靠，可用来预测试验结果。一次项中，酶添加量（A）、酶解时间（B）、料液比（C）、温度（D）、pH 值（E）这5个因素对水解度影响的主次顺序为D＞A＞C＞B＞E，且都极显著影响水解度（p＜0.01）。在二次项中，各因素均影响极显著（p＜0.01），但各因素间交叉项对于水解度的影响较小（p＞0.05），仅有A和D交互项影响极显著（p＜0.01）。

根据金枪鱼骨胶原肽水解度的回归方程，利用Design Expert分析软件可以得到各因素交互作用的响应面图，其中酶添加量和温度之间的相互作用如图7所示。

图7 酶添加量和温度对水解度的交互作用Fig.7 Interaction of enzyme addition and temperature on degree of hydrolysis

响应面图较为直观地反映两个因素对水解度的影响，当响应值越敏感时，其在响应曲面图中的曲线变化趋势越大，坡度则越陡，颜色也愈加深。从图7中可以看出，随着酶添加量不断升高，水解度逐渐增加；随着温度的升高，水解度则先增加后减小。酶添加量和温度的交互作用对水解度的影响较大，表现为响应面曲线走势较陡峭，颜色也逐渐由浅变深，说明金枪鱼骨胶原肽水解度对酶添加量和温度的交互作用较为敏感，与方差分析结果一致。

2.4 水解度最优制备工艺条件的确定与验证

根据响应面分析得到最优酶解条件为酶添加量2.52%、酶解时间 8.38 h、料液比 0.09 ∶1（g/mL）、温度53.64℃、pH 7.08，此时理论上金枪鱼骨胶原肽水解度最高，为66.68%。为了便于实际操作，将酶解条件修正为酶添加量 2.5%、酶解时间 8 h、料液比 0.09∶1（g/mL）、温度53℃、pH 7.0。在该条件下进行3次平行试验，测得水解度为65.43%，与理论值接近。这表明该模型适用于金枪鱼骨胶原肽酶解工艺的分析和预测。

2.5 游离氨基酸组成分析

大多数游离氨基酸不仅自身具有特殊滋味，还可以通过脱羧、脱氨等作用生成其他挥发性风味前体物质[20]，并具有增鲜和提高机体免疫力等作用[21]。对最优酶解工艺进行放大试验，过膜后得到两个不同分子级的骨胶原肽，分别命名为骨胶原肽1（bone collagen peptides 1，BCP1，分子量为 250 Da～1 000 Da）、骨胶原肽 2（bone collagen peptides 2，BCP2，分子量为 1 000 Da～3 500 Da），骨胶原肽中的游离氨基酸组成见表5。

表5 骨胶原肽中的游离氨基酸组成Table 5 Composition of free amino acids in bone collagen peptides

续表5 骨胶原肽中的游离氨基酸组成Continue table 5 Composition of free amino acids in bone collagen peptides

由表5可知，金枪鱼骨胶原肽中的氨基酸种类丰富，两种不同分子量的骨胶原肽中均能检测到17种游离氨基酸，在总含量上BCP1远大于BCP2。两者在组成上也存在一定差异，BCP1中必需氨基酸占游离氨基酸总量的42.02%，含量最高的必需氨基酸是赖氨酸，占游离氨基酸总量的10.27%。而BCP2中必需氨基酸占游离氨基酸总量的31.53%，其中含量最高的必需氨基酸也是赖氨酸（11.33%）。由此可见，金枪鱼骨胶原肽可以满足人体对必需氨基酸的需求，利用价值高。

3 结论

本试验以金枪鱼骨为原料，从5种蛋白酶中筛选出动物蛋白酶为酶解制备骨胶原肽的最佳蛋白酶，并通过单因素试验及响应面试验分析，优化得到最优工艺条件为酶添加量 2.5%、pH7.0、料液比0.09∶1（g/mL）、温度53℃、酶解时间8 h，此时水解度为65.43%。在该条件下，进行工艺放大试验和过膜精制，得到两个不同分子级的骨胶原肽（BCP1和BCP2），对其游离氨基酸组成进行分析，发现胶原肽中氨基酸种类丰富，利用价值高。该研究有望减少金枪鱼骨资源的浪费，为使用动物蛋白酶水解金枪鱼骨获得骨胶原肽提供参考，为进一步充分开发利用金枪鱼骨胶原肽提供了理论和试验基础。