苗玥，王秋萍*，谭超，彭春秀，龚加顺*

（1.云南农业大学食品科学技术学院，云南 昆明 650201；2.云南农业大学园林园艺学院，云南 昆明 650201）

核桃营养价值丰富，有“万岁子”、“长寿果”、“养生之宝”的美称。核桃仁中含有丰富的蛋白质[1]、脂肪酸和各种微量元素等多种对人体有益的营养物质，具有很高的药用价值和营养价值[2]。近年来，大量研究表明，核桃仁中含有大量的不饱和脂肪酸，是大脑组织细胞的主要结构脂肪，能软化血管、预防高血压和心脏病，具有“动脉清道夫”的美誉[3]。荣瑞芬等[4]对鲜核桃内种皮总酚和总黄酮进行了分析测定，研究表明核桃内种皮中酚类物质和黄酮类物质都明显高于核桃仁中营养物质，其中酚类物以没食子酸含量最高；黄酮类物质以芦丁含量最高。阿布力孜等[5]研究发现核桃分心木中黄酮类物质含量最高，远远高于核桃仁及核桃内种皮含量。黄酮类物质在治疗疾病和食品添加剂方面有较为广泛的应用，它可以通过促进抗氧化酶和抑制氧化酶的产生从而清除人体内的游离自由基，起到延缓衰老、预防心血管疾病和癌症等作用[6]。

21世纪以来，随着人类平均预期寿命的不断延长，衰老和抗衰老已经成为世界生命科学研究的热点之一。寻找有效的天然产物作为预防衰老的药物是目前的研究热点。Gorji等[7]研究发现坚果类食品中富含的常量营养素、微量营养素和植物化学物质是预防脑萎缩和记忆力衰退的重要物质。乙醇会引起星形胶质细胞的活化使其过量的表达纤维酸性蛋白（glial fibrillary acidic protein，GFAP）从而导致神经变性或引起记忆力损伤[8]。核桃中富含的多不饱和脂肪酸可以改善动物记忆、认知和神经效应相关的氧化应激（oxidation stress，OS）反应和炎症（inflammatory factor，INF）[9]。核桃内种皮及核桃分心木中所含的黄酮类物质具有较强的还原力和DPPH自由基清除活性，可以作为抗氧化成分的新来源[10]。

当前国内外采用核桃仁、核桃内种皮、核桃分心木对小鼠记忆力影响的对比研究尚未见报道。本实验采用核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物、核桃分心木水提物及40%酒精衰老模型组做对比研究，探索不同部位核桃的抗衰老作用，以期为下一步开发功能性核桃产品提供理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与仪器

新鲜核桃：大理白族自治州漾濞彝族自治县；石油醚、无水碳酸钠、磷酸、无水葡萄糖、没食子酸、苯酚：天津市风船化学试剂科技有限公司；硫酸、盐酸：重庆川东化工有限公司；考马斯亮蓝G250：上海源叶生物科技有限公司；福林酚：北京索莱宝科技有限公司。以上所用试剂均为分析纯。血清总胆固醇试剂盒、血清总甘油三脂试剂盒、血清高密度脂蛋白试剂盒、血清低密度脂蛋白试剂盒：上海科华生物工程股份有限公司。

SA 220型自动记录水迷宫：江苏赛奥斯生物科技有限公司；旷场实验箱：云南农业大学食品科学技术学院自制；FD-1 A-50冷冻干燥机：上海比朗仪器制造有限公司；HH-8数显电子恒温水浴锅：常州国华电器有限公司；JM-L80胶体磨：上海诺尼轻工有限公司；RE-52旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；AU-680全自动生化分析仪：美国贝克曼库尔特公司。

SPF级雄性昆明种小鼠[实验动物生产许可证号：SCXK（滇）k 2015-0002，体重（20±2）g]、基础饲料：昆明医科大学实验动物学部。

1.2 方法

1.2.1 核桃仁冻干粉、核桃内种皮及核桃分心木水提物样品的制备

新鲜的大理漾濞核桃剥壳后，分为去皮核桃仁、核桃内种皮及核桃分心木三部分。将去皮核桃仁与水按照料液比1∶2（g/mL）打浆，过胶体磨直至无颗粒状核桃仁，冷冻干燥得到核桃仁粉。分别将新鲜核桃内种皮及分心木置于恒温干燥箱中干燥，粉碎，水浴浸提[料液比 1 ∶20（g/mL）、85 ℃、1 h]，过滤，滤液浓缩后冷冻干燥，分别得到核桃内种皮及分心木水提物。

1.2.2 主要成分测定方法

1.2.2.1 粗蛋白含量的测定

分别称取粉末状新鲜核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物、核桃分心木水提物0.5 g，参照GB 5009.5—2016《食品安全国家标准食品中蛋白质的测定》中凯氏定氮法，经消化、蒸馏、滴定测定样品的蛋白质含量，计算公式中氮换算为粗蛋白质需要乘以6.25，每个样品重复测定3次。

1.2.2.2 脂肪含量的测定

分别称取新鲜核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物、核桃分心木水提物1 g，参照GB5009.6—2016《食品安全国家标准食品中脂肪的测定》中索氏抽提法，每个样品重复测定3次。

1.2.2.3 总糖含量的测定

分别称取粉末状新鲜核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物、核桃分心木水提物2 g，参照管美玉等[11]的苯酚-硫酸比色法，每个样品重复测定3次。吸光度A与多糖含量的回归方程为y=5.858 1x+0.055 1，R2=0.993 8。

1.2.2.4 氨基酸含量的测定

参照邵金良等[12]的方法，使用茚三酮比色法，每个样品重复测定3次。得到吸光度A与氨基酸含量的回归方程为 y=2.087 7x+0.029 4，R2=0.989 9。

1.2.2.5 总多酚、总黄酮的含量测定

根据李杰等[13]的福林酚比色法，称取样品0.5 g加入蒸馏水10 mL，超声30 min得到待测液。取待测液0.5 mL加入0.5 mL福林酚和1 mL饱和Na2CO3并定容至10 mL，在暗处放置35 min后在765 nm波长处测定吸光度，重复测定3次，取平均值。得到多酚含量与吸光度A的回归方程：y=0.077 1x-0.000 7，R2=0.991 8。

总黄酮测定：于2 mL离心管中，加入1 mL上述待测液、0.5 mL HCl（浓盐酸 ∶水=1 ∶4，体积比）、0.5 mL 35%甲醛，暗处放置24 h后，3 000 r/min离心5 min，上清液即为非黄酮含量，将上清液按照上述福林酚比色法测定。总黄酮含量=总多酚含量-非黄酮含量[14]。

1.2.3 实验动物的分组与饲喂管理

1.2.3.1 动物饲喂

选SPF级昆明种小鼠88只，在空调动物饲养室中同室单笼饲养，自由摄食，自由饮水。每天更换一次垫料、鼠笼，清洗饮水瓶。饲养温度控制在（24±2）℃，相对湿度（60±10）%，所有小鼠均统一饲喂基础饲料。

1.2.3.2 动物组别设计

将88只小鼠适应性饲养一周，随机分成11组，每组8只，分别为正常对照组、模型组、核桃仁冻干粉低、中、高剂量组，核桃内种皮水提物低、中、高剂量组和核桃分心木水提物低、中、高剂量组，正常对照组灌胃等容量生理盐水，模型组灌胃等容量40%酒精[15-16]，连续灌胃28 d。每7 d称体重1次，按体重变化调整灌胃剂量。

1.2.3.3 灌胃剂量

根据“动物与人体的每公斤体重剂量折算系数表”来计算小鼠灌胃的剂量，并按照1、2、4倍来选择低中高剂量，即核桃仁粉低、中、高剂量组灌胃量分别为3.60、7.20、14.40 g/kg·bw；核桃内种皮水提物低、中、高剂量组灌胃量分别为 2.45、4.90、9.80 g/kg·bw；核桃分心木水提物低、中、高剂量组灌胃量分别为0.70、1.40、2.80 g/kg·bw。

1.2.4 旷场实验

旷场实验于灌胃28 d后开始，实验期间继续灌胃小鼠，于灌胃后1 h按灌胃顺序进行旷场实验。将开口的黑色测试箱（60 cm×60 cm×30 cm）箱底等分成25个正方形的方格（12 cm×12 cm），小鼠放进测试箱中适应环境3 min后开始实验，每只小鼠进行1次测试。参照Lin等[17]的方法，将小鼠放入旷场行为测试箱的中心位置，让其在旷场中自由探索环境5 min，记录小鼠在5 min内跨越的方格总数和后肢直立次数，每一次实验之后，用75%乙醇及时清理干净旷场测试箱中粪便及尿液，以避免之前小鼠所留下的气味对后续实验造成影响。

1.2.5 自动记录水迷宫实验

旷场实验结束后第2天开始进行自动记录水迷宫实验。实验连续进行6 d，前5d为定位航行实验，第6天为空间测试实验[18]。定位航行实验方法：每天训练3次，每次将小鼠从迷宫入口处放入水中，同时开始计时并用鲜艳的绿色棍子引导小鼠寻找迷宫出口，记录小鼠从入水到找到迷宫出口所需的时间，即逃避潜伏期。如果5 min内未成功找到出口，则将小鼠引导上岸，并让其在岸上休息2 min，此时逃避潜伏期记为不合格。空间测试实验方法：第6天撤去引导物，同样将小鼠从迷宫入口处放入水中，让小鼠在迷宫中寻找出口，并记录小鼠到达出口所需时间。

1.2.6 标本采集处理与生化指标检测

行为学实验之后，所有小鼠禁食、禁水12 h，然后称量体重，摘除眼球取血，取血后，小鼠迅速脱颈处死。所采集血液于4℃、3 000 r/min离心15 min，取上清液分装，一部分用于小鼠血脂四项的检测，另一部分冻存于-80℃。

血清总胆固醇（total cholesterol，TC）、血清总甘油三脂（total triglycerides，TG）、血清高密度脂蛋白（high density liptein cholesterol，HDL-C）、血清低密度脂蛋白（low density lipoprotein cholesterol，LDL-C）含量的测定均根据对应试剂盒方法，采用AU-680全自动生化分析仪测定。

1.3 数据统计分析

采用SPSS 18.0软件进行统计分析，结果表示为平均值±标准值，组间比较采用单因素方差分析，P＜0.05表示差异显著；采用GraphPad 8.0.2绘图。

2 结果与分析

2.1 核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物基本营养成分

核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物主要成分见表1。

表1 核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物主要成分Table 1 Main components of walnut kernel powder，water extract of walnut kernel pellicle and walnut diaphragm g/100 g

由表1知，核桃分心木水提物脂肪含量显著低于核桃仁冻干粉及核桃内种皮水提物（P＜0.05）；核桃仁冻干粉总糖含量、蛋白质含量显著高于核桃内种皮及核桃分心木水提物（P＜0.05）；核桃内种皮水提物氨基酸含量显著低于其他两组（P＜0.05）；核桃分心木水提物总多酚、总黄酮含量较为丰富，显著高于其他两组。

2.2 核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物对小鼠体重及摄食量的影响

核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物对小鼠体重及摄食量的影响见表2、表3。

表2 核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物对小鼠体重的影响（n＝8）Table 2 Effects of walnut kernel powder，water extract of walnut kernel pellicle and walnut diaphragm on the body weight of mice（n=8）g

表3 核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物对小鼠摄食量的影响（n＝8）Table 3 Effects of walnut kernel powder,water extract of walnut kernel pellicle and walnut diaphragm the intake of mice（n=8）g/d

续表3 核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物对小鼠摄食量的影响（n＝8）Continue table 3 Effects of walnut kernel powder,water extract of walnut kernel pellicle and walnut diaphragm the intake of mice（n=8）g/d

小鼠的体重增长情况及摄食量是反映生长发育的一个重要指标[19]。由表2、表3可以看出，模型组和核桃内种皮水提物低、高剂量组体重与正常对照组相比显著降低（P＜0.05）；而核桃仁冻干粉低、高剂量组摄食量与正常对照组相比显著增加（P＜0.05），核桃分心木水提物组摄食量与正常对照组相比差异不显著。说明核桃仁冻干粉、核桃分心木水提物对小鼠的生长发育无不良影响，且核桃内种皮水提物能使小鼠体重降低。其中核桃内种皮水提物高剂量组在灌胃14 d后小鼠死亡一半[LD50＞9.80 g/（kg·d）]。张泽生等[20]的研究表明核桃内种皮多酚提取物，可减轻小鼠脑部的氧化损伤。其灌胃剂量最高为0.8 g/（kg·d），但本实验是根据核桃内种皮水提物中黄酮含量来计算灌胃剂量，未考虑到其他活性化合物含量对其的影响。因此说明高剂量或者不合理的用药均会对小鼠的健康产生不利影响[21]。

2.3 旷场实验结果分析

核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物对小鼠运动探究能力的影响见图1。

图1 核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物对小鼠运动探究能力的影响（n＝8）Fig.1 Effect of walnut kernel powder，water extract of walnut kernel pellicle and walnut diaphragm on sports exploring ability of mice（n＝8）

旷场实验可以用于检测小鼠在新环境中的自主探索、运动能力和紧张恐惧的状态[22]。由图1可知，模型组与正常对照组相比，小鼠跨越方格数和后肢直立次数均显著减少（P＜0.05），说明40%酒精致衰老小鼠模型的运动探究能力受到严重损害。核桃仁冻干粉高剂量组、核桃分心木水提物高剂量组与正常对照组相比穿越方格数和后肢直立次数均显著增加（P＜0.05）；核桃仁冻干粉低、中、高剂量组，核桃内种皮水提物低、中剂量组和核桃分心木水提物低、中、高剂量组后肢直立次数均显著高于模型组（P＜0.05），说明核桃仁冻干粉及核桃分心木水提物能减轻致衰老因子的伤害，促进小鼠的自主运动能力。Shabani等[23]的研究表明核桃仁可能对顺铂诱导的运动和认知功能紊乱有保护作用。本研究发现核桃内种皮水提物、核桃仁冻干粉、核桃分心木水提物在一定的剂量条件下能够在一定程度上提高衰老小鼠的探究能力。

2.4 自动记录水迷宫结果分析

2.4.1 定位航行实验

核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物对小鼠在水迷宫中逃避潜伏期的影响见表4。

表4 核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物对小鼠在水迷宫中逃避潜伏期的影响（n＝8）Table 4 Effect of walnut kernel powder,water extract of walnut kernel pellicle and walnut diaphragm on escape latency of mice in water maze tes（tn=8）s

由表4可知，随着训练时间的延长，各组小鼠的逃避潜伏期均有所下降，且显著性差异不大，说明小鼠并不是因为人为训练而产生机械记忆，从而缩短其到达平台的时间。从训练第1天开始，模型组小鼠的逃避潜伏期显著长于正常对照组（P＜0.05），说明模型组小鼠学习记忆能力衰退严重。核桃仁冻干粉低、中、高剂量组，核桃内种皮水提物低、中、高剂量组及核桃分心木水提物低、中、高剂量组的逃避潜伏期与模型组相比显著降低（P＜0.05）。其中到第5天时核桃仁冻干粉高剂量组与其他组相比用时较短，其次为核桃分心木水提物高剂量组。Willis等[24]的研究发现在Morris水迷宫中，所有剂量的核桃仁都能改善工作记忆，但9%的核桃仁摄食量使大鼠记忆受损，因此适量的核桃膳食补充剂可以改善老年大鼠的认知和运动表现。而本研究发现核桃仁冻干粉高剂量组对改善学习记忆再现障碍效果更优，其余各给药组与模型组和正常组相比改善空间学习记忆力明显更优。

2.4.2 空间测试实验

核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物对小鼠在水迷宫中测试期到达平台时间的影响见图2。

图2 核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物对小鼠在水迷宫中测试期到达平台时间的影响（n＝8）Fig.2 Effect of walnut kernel powder，water extract of walnut kernel pellicle and walnut diaphragm time of reaching platform of mice in water maze test（n=8）

由图2可以看出，模型组小鼠测试期到达平台时间较正常对照组显著延长（P＜0.05）。核桃仁冻干粉低、中、高剂量组，核桃内种皮水提物低、中、高剂量组及核桃分心木水提物低、中、高剂量组测试期到达平台时间与模型组相比均显著下降（P＜0.05），而与正常对照组相比核桃仁冻干粉高剂量组、核桃内种皮水提物高剂量组及核桃分心木水提物高剂量组显著下降（P＜0.05）。其中核桃仁冻干粉高剂量组及核桃分心木水提物高剂量组表现最佳。说明一定剂量的核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物对小鼠记忆力有明显的改善效果。Zhao等[25]的研究表明核桃油胶囊具有消除自由基、增强抗氧化能力、减轻氧化应激损伤的作用，可用于抗衰老食品中。核桃内种皮多酚提取物可显著提高小鼠血清、肝脏和脑组织中超氧化物歧化酶、过氧化氢酶、谷胱甘肽过氧化物酶活力和总抗氧化能力，并降低丙二醛含量[26]。高莉等[27]研究发现核桃分心木浸提液中的有效活性成分如黄酮等对枯草芽孢杆菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、产气杆菌都有抑菌活性。本研究表明核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物、核桃分心木水提物对小鼠的记忆力有一定的影响。

2.5 核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物对小鼠血脂的影响

核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物对小鼠血脂的影响见图3。

图3 核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物及核桃分心木水提物对小鼠血脂的影响（n=8）Fig.3 The content of serum TG，TC，LDL-C and HDL-Con walnut powder，water extract of walnut kernel pellicle and walnut diaphragm in mice（n=8）

由图3可以看出，模型组、正常对照组、核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物、核桃分心木水提物各剂量组间TG含量无显著性差异（P＞0.05），但核桃仁冻干粉有降低小鼠TC、LDL-C含量的趋势，核桃分心木水提物组随着剂量的升高TG含量有下降的趋势。核桃内种皮水提物高剂量组的TC、LDL-C、HDL-C含量与正常组相比显著降低（P＜0.05）。核桃分心木水提物低、中、高剂量组与正常组相比HDL-C含量显著升高（P＜0.05）。在Guasch-ferré等[28]的研究中将核桃按日常摄入总热量的10%～24%计算加入到日常饮食中，发现添加核桃组与对照日粮组相比，吃核桃使总胆固醇和低密度脂蛋白浓度显著降低，而对高密度脂蛋白和甘油三酯的影响不显著。Scott等[29]的一项为期一年的研究发现核桃降低了DM2患者的高密度脂蛋白含量，而另一项为期6个月的研究发现核桃组与对照相比总胆固醇、甘油三脂和低密度脂蛋白的含量都下降了。上述研究结果与本实验基本相似。本研究发现适量食用核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物、核桃分心木水提物可以调节小鼠血脂。

3 结论

本实验以灌胃40%酒精建立模型组，通过与正常对照组及模型组的对比，探究核桃仁冻干粉、核桃内种皮水提物、核桃分心木水提物对小鼠记忆的影响作用。实验发现高剂量的核桃仁冻干粉能促进小鼠的自主运动能力，提高小鼠的探究能力及提高小鼠的记忆能力（P＜0.05）。食用核桃仁冻干粉 TG、TC、LDL-C、HDL-C含量无显著性影响，但有降低小鼠TC、LDL-C含量的趋势。核桃内种皮水提物高剂量组在旷场实验中跨越方格数及后肢直立次数显著低于正常组（P＜0.05），说明核桃内种皮水提物对小鼠的体质有一定的影响。但在自动记录水迷宫实验中高剂量组与正常对照组相比均显著下降（P＜0.05）。核桃内种皮水提物高剂量组TC含量显著降低（P＜0.05）。但核桃内种皮水提物高剂量组灌胃14d后小鼠死亡一半[LD50＞9.80g/（kg·d）]。分析原因可能是由于以黄酮含量为灌胃剂量指标计算可能会导致核桃内种皮中其他活性物质含量过高，而导致小鼠自主运动能力和对记忆能力的改善作用降低。高剂量的核桃分心木水提物能促进小鼠的自主运动能力，提高小鼠的探究能力及提高小鼠的记忆能力（P＜0.05）。核桃分心木水提物低、中、高剂量组TG、TC、LDL-C含量与正常组相比无显著性差异，而HDL-C含量显著升高（P＜0.05）。以上结果表明核桃仁冻干粉、核桃分心木水提物及一定剂量的核桃内种皮水提物对小鼠自主运动探究能力、记忆力有明显的改善作用，且能调节小鼠血脂，同时说明不同部位的核桃在记忆力食品开发的方面具有良好的应用前景。