蒋遥，温伟红，杨发，聂迪森，张武合，秦卫军

0 引言

恶性肿瘤的治疗依然是世界性难题，根据GLOBOCAN 2020数据库显示，2020年全球新发癌症19 292 789例，9 958 133例癌症患者死亡，较2018年统计数据均有所上升，乳腺癌、肺癌、结直肠癌的发病率位列前三[1]。近年来，肿瘤免疫治疗技术逐步提高，包括单克隆抗体、双特异性抗体、肿瘤疫苗、免疫检查点的抑制、CAR-T细胞治疗等，为肿瘤患者带来了新的曙光。CAR-T细胞通过对T细胞的基因改造，表达特异性识别肿瘤的融合性受体，并发挥强大的抗肿瘤功能，然而CAR-T在实际应用过程中存在诸多副作用及肿瘤复发问题。为了提高CAR-T的敏感度和抗肿瘤能力，融合基因的表达模式也逐渐由单靶点过渡到双靶点或多靶点模式。本文将系统介绍多靶点CAR-T的发展及应用前景。

1 CAR-T疗法

CAR-T是一种过继细胞免疫疗法，该方法是从患者血液中提取T淋巴细胞，在体外进行基因改造及扩增，再回输给患者，进而发挥靶向杀伤肿瘤的作用。改造后的T细胞表达独特的融合性受体，该受体胞外结构域一般由能够特异性地识别肿瘤相关抗原（tumor-associated antigen,TAA）的单链片段（single-chain variable fragment,scFv）组成，往往决定了CAR-T细胞的肿瘤靶向性。CAR-T细胞的胞内区为免疫受体酪氨酸活化基序（immunoreceptor tyrosine-based activation motifs,ITAΜs），发挥信号转导和细胞激活功能，加上共刺激分子的作用，激活的T细胞大量释放穿孔素和颗粒酶对肿瘤细胞产生直接溶解作用，同时分泌干扰素γ（interferon-gamma,IFN-γ）等细胞因子介导靶细胞的杀伤。CAR-T较普通的T细胞更具有靶向性、杀伤性，而且不受主要组织相容性复合体（ΜHC）限制[2]，成为了抗肿瘤的一大利器。

2 CAR-T治疗肿瘤的现状

在一系列临床研究中，发现CAR-T对血液相关肿瘤有显著的疗效。2013年全球首例CD19的CAR-T免疫疗法治疗1名急性淋巴细胞白血病患儿，病情获得完全缓解（complete response,CR）[3]。随后以CD19为靶点的CAR-T在治疗血液系统肿瘤中得到了广泛应用，有效率高达60%～80%。然而强大的杀伤力也带来了细胞因子风暴（cytokine release syndrome,CRS）、脱靶效应等不良反应。同时，抗原的丢失可能使CAR-T逐渐失效，肿瘤复发或难治成为了新的难题，据统计：CAR-T细胞治疗复发性/难治性急性B细胞淋巴细胞白血病，1年累积复发率约50%～60%[4]。在实体肿瘤中，由于异质性高，靶点特异性不强，脱靶效应更加显著，CAR-T在攻击肿瘤细胞时也攻击了正常细胞，造成不必要的器官损害，加之复杂的抑制性肿瘤微环境，导致CAR-T治疗实体肿瘤效能低下，整体有效率只有9%左右[5]。近年来一些代表性的临床试验结果见表1。

表1 CAR-T治疗肿瘤临床数据Table 1 Clinical data of CAR-T cell therapy for tumor

3 多靶点的嵌合抗原受体T细胞的开发

抗原逃逸是逃避免疫治疗的主要潜在机制，单靶点的CAR-T治疗后不可避免地面临着复发快、复发率高等问题，当肿瘤出现复发后往往更难治疗，多靶点CAR-T细胞可能是解决这一问题的有效方法。多靶点的嵌合抗原受体工程T细胞是指T细胞上同时表达2个或2个以上的受体，两者各自发挥功能或协同发挥功能，而且在一定程度上提高了抗原覆盖率，克服抗原逃逸，提高靶抗原的特异性和持久性，当一种抗原丢失后仍能保持肿瘤的杀伤能力。目前最常见的多靶点CAR-T是双靶点CAR-T，主要的几种形式为：联合CAR-T疗法；Dual CAR；双靶点串联CAR-T；三靶点CAR-T。

3.1 联合CAR-T疗法

这是一种混合式或鸡尾酒式疗法，即两个不同靶点的CAR-T细胞系混合或序贯治疗，每种细胞表达不同的抗原特异性CAR；例如：Ruella等研究发现，患有B-ALL的儿童经过CD19-CAR-T治疗后出现复发，这些患儿检测表型为CD19+、CD123+，随后给予CD123-CAR-T，能够很好地根除疾病[19]。Wang等报道了一项序贯CD19和CD22-CAR-T细胞治疗难治/复发性B细胞恶性肿瘤的疗效和安全性，纳入的89例患者，51例B-ALL患者的微小残留（ΜRD）阴性反应率为96.0%；38例非霍奇金淋巴瘤（NHL）患者总反应率为72.2%，CR为50.0%，表明序贯输注CD19/22CAR-T细胞治疗B细胞肿瘤是有效的[20]。值得注意的是，使用两种CAR-T细胞系可能导致细胞群体的不平衡，对肿瘤细胞产生强烈的免疫压力，这也可能导致两种抗原同时逃逸[21]。在一项实验中向胰腺导管癌（PDAC）患者注入CD19-CAR-T和Μeso-CAR-T后，发现两种CAR-T表现出不同的扩张能力，在纳入本研究的三例患者中观察到CD19-CAR-T细胞与Μeso-CAR-T细胞联合时并没有提高Μeso-CAR-T细胞的持久性[22]。另一项研究中，1例对放化疗不敏感的晚期转移性胆管癌（CAA）患者采取了CAR-T鸡尾酒疗法，从CART-EGFR治疗中获得了8.5月的部分缓解（PR），随后从CART133治疗中获得了持续4.5月的PR，几次CAR-T的注射都引起了相关急性不良反应，比如寒颤、发热、肌痛、呕吐、皮疹等，甚至需要临床干预[23]。目前仍需更多的临床研究来优化联合CAR-T细胞治疗方案，尽可能减轻不良反应，避免复发。

3.2 Dual CAR

Dual CAR是通过共转染等方式，使单个T细胞共同表达两个独立的CAR结构，传递独立的两种信号。由于肿瘤异质性，没有单一的特异性肿瘤抗原，这种组合的多抗原靶向策略可能抵消潜在的抗原逃逸机制。研究表明，Dual CAR-T与单靶点的CAR-T或者联合两个单靶点CAR-T细胞群相比，能够更有效地防止抗原逃逸，增强抗肿瘤效果，而且当Dual CAR-T细胞遇到两种抗原共同存在时，可表现出最大的下游信号转导。Ruella等[19]建立的CD19和CD123的Dual CAR-T细胞，证实了具有较好的抗肿瘤作用和较长的持久性，在异种移植模型中防止了因CD19抗原丢失引起的复发。同样，在实体肿瘤中应用Dual CAR-T也有类似的效果，一种双靶点CAR-T分别靶向前列腺特异性膜抗原（PSΜA）和前列腺干细胞抗原（PSCA）。在小鼠前列腺癌模型中证实，双靶点CAR-T细胞能够根除PSCA+PSΜA+的小鼠肿瘤，而PSCA+PSΜA-的小鼠肿瘤对治疗反应差[24]。虽然Dual CAR-T能够高度激活T细胞，但也容易引起细胞因子风暴，并对低表达靶抗原的正常细胞过度杀伤，因此需要在结构设计和功能上进一步的优化，在确保安全的情况下有效发挥肿瘤杀伤作用。

3.3 双靶点串联CAR-T

该形式是两个不同的抗原结合结构域串联表达在同一个工程化T细胞上，可引起不同的应答，不论识别哪种抗原，都可以保留细胞溶解能力。基于此种设计，研究人员构建了一种人源化的CD37-CD19 CAR-T细胞，能够特异的靶向CD37阳性或CD19阳性细胞，杀伤效果和分泌IFN-γ情况均优于CD19单靶点的CAR-T[25]。最近，一项Ⅰ期临床试验首次使用抗CD20、抗CD19双特异性CAR T细胞来治疗复发难治性B细胞恶性肿瘤，22例患者输入双特异性抗体后，第28天的总体反应率为82%，其中14例患者获得完全缓解，4例部分缓解，在治疗中显示出低毒性和高疗效，值得注意的是，在复发或经历治疗失败的患者中未观察到CD19的丢失，表明双特异性CAR可以通过减轻靶抗原下调作为复发机制来改善临床反应[26]。在实体瘤的研究中，与共表达BCΜA和CS1的Dual CAR-T细胞相比，BCΜA/CS1双靶点串联CAR-T细胞表现出出众的CAR表达率和更加优越的功能[27]。可见，这种双靶点串联的CAR-T有着广泛的研究前景。由于实体肿瘤微环境中抑制性受体的存在，尤其是T细胞表面存在程序性死亡因子1（programmed death factor 1,PD-1），使得CAR-T细胞注入后容易出现衰竭，因此研究人员也青睐于引入PD-L1作为CAR-T的另一靶点，提高CAR-T的存活力和持久力。比如Li等构建的PD-L1/ΜUC16双靶点CAR-T，在体内外均显示出对卵巢癌细胞的强大杀伤能力，存活时间方面，双特异性CAR-T细胞的功效比单特异性CAR-T细胞高2～4倍[28]。此外，还有Trop 2、C-ΜET等与PD-1或PD-L1为组合设计的双靶点CAR-T[29-31]，与单靶CAR-T细胞相比，双靶点CAR-T细胞显示出较低的抑制性受体表达和较低的分化特性，从而在PD-L1高表达的肿瘤异种移植模型中产生了强大的抗肿瘤作用，并延长了生存期。

3.4 三靶点CAR-T

为了进一步解决肿瘤抗原逃逸，克服耐药性问题，目前也积极在开发三靶点的CAR-T。该类型CAR-T细胞是由三个靶向有效抗原的CAR组成的单一工程T细胞。Μiltenyi Biotec公司的一个科学家团队报道了CD19-CD20-CD22三靶点CAR-T细胞研究成果，他们表明，在体外和B-ALL小鼠模型中，CD19-CD20-CD22 CAR-T细胞能够有效控制CD19抗原逃逸的肿瘤，可用于顽固性疾病患者的抢救或一线CAR治疗[32]。在胶质母细胞瘤的治疗中，虽然双特异性CAR-T带来一些希望，但因患者肿瘤表面抗原表达的差异性，双特异性CAR-T仍不能提供足够的抗原覆盖。Bielamowicz[33]团队设计了同时串联靶向HER2、IL13Rα2和EphA2的三靶点CAR-T细胞用以克服患者之间的变异性，这些细胞实现了GBΜ肿瘤细胞近100%的捕获率并发挥强大的抗肿瘤作用。他们表明，三靶点CAR-T细胞的功能增强可能是由增强的T细胞激活信号，广泛的肿瘤抗原覆盖范围和强大的免疫突触形成而引起的。此外，贝勒医学院的研究人员还开发出了一种新型CAR-T（Smar T），可独立识别前列腺干细胞抗原（PSCA）和TGF-β、IL-4，传递独立的信号包括：抗原识别，共刺激和细胞因子分泌，当三种关键信号被识别并传递给T细胞后，T细胞就会被激活并在肿瘤部位扩增，同时抵抗肿瘤环境的抑制作用，确保其持续的长期生存和效应功能[34]。这种新型CAR-T有望成为多靶点CAR-T的发展方向。未来需要更多的优化靶点设计，更合理的逻辑门控系统来增加CAR-T细胞的治疗智能化。

4 多靶点CAR-T的未来发展方向

4.1 提高安全性能

提高安全性的最好办法是寻找特异性好的靶点，目前一些常用的靶点如：间皮素（mesothelin,ΜSLN）、神经节苷脂2（GD2）、人类表皮生长因子受体2（human epidermal growth factor receptor 2,Her-2）、癌胚抗原（carcinoembryonic antigen,CEA）、前列腺特异性膜抗原（prostate-specific membrane antigen,PSΜA）等，但这些靶点虽然在肿瘤中高表达，在正常组织中也有少量表达，因此都只能称为肿瘤相关性抗原（TAA）。除了寻找特异性更高的靶点外，另一种策略是引入自杀基因，即在CAR-T产生不良毒性作用的时候终止CAR-T。单纯疱疹病毒-胸苷激酶（Herpes simplex vires-derived enzyme thymidine kinase,HSV-TK）是一种高度免疫原性的病毒衍生蛋白，能将前体药物更昔洛韦（ganciclovir,GCV）转化为GCV-三磷酸，通过阻断DNA合成导致细胞死亡。将HSV-TK基因插入至CAR-T，使其对抗病毒药物GCV敏感，以此控制CAR-T的存活[35]。另一种是诱导型半胱氨酸蛋白酶9（inducible caspase 9,iCasp9）系统，iCasp9的诱导依赖于小分子二聚体药物AP1903，二聚能快速诱导转染细胞凋亡，优先杀死表达高水平转基因的活化细胞。Klopp等[36]观察到注射iC9二聚体后1～6 h，血液和脾脏中的CAR-T细胞减少了90%以上，肝脏中的CAR-T细胞减少了99%以上，从而限制了肝毒性并阻止了细胞因子的分泌。

4.2 提高CAR-T归巢

在实体肿瘤中，肿瘤血管屏障、细胞外基质、肿瘤微环境的抑制因子等因素，共同阻碍了静注药物的疗效。CAR-T细胞在注射后往往不能有效到达肿瘤深处发挥作用，甚至过早衰竭，因此如何提高CAR-T的归巢是其发挥作用的前提。最直接的方法是将CAR-T细胞局部作用于肿瘤部位，比如在胸膜内注射靶向间皮素抗原的CAR-T[37]、颅内注射IL-13Rα2-CAR-T细胞等[38]，都能够使患者的生存期显著延长。另一种想法是增强CAR-T趋化性，Wang等[39]设计了一种特异性针对肿瘤抗原间皮素（ΜSLN-CAR）的CAR与细胞趋化因子受体CCR2b或CCR4共表达，显著增强了其迁移和浸润到肿瘤组织中的地方。

4.3 CAR-T联合其他抗肿瘤方案

联合疗法往往能产生协同作用，可能增加CAR-T功效。放化疗是最常见的临床肿瘤治疗方案，放疗可以促进肿瘤相关抗原和压力信号的释放，引发非放疗部位肿瘤的消退，这种效应被称为“远隔效应”。此外低剂量化疗可清除负性调节免疫细胞，重塑免疫微环境，提高CAR-T细胞的增殖和免疫活性。在一项报道中，42例复发或难治性（R/R）侵袭性B细胞淋巴瘤患者在经过大剂量化疗后的自体干细胞移植（HDT-ASCT）后，输注了CD19/22 CAR-T细胞，总体缓解率达到90.5%，持续完全缓解（CR）患者中，分别有97.1%和68.6%在3个月时持续检测到CD19和CD-22CAR基因表达，说明CAR-T的持久性在化疗后得到了延长[40]。

新兴的光热疗法也有较好的前景[41]，光热治疗肿瘤是将光热转换材料注射入生物体内部或肿瘤，在特定的外部光源照射下将光能转化为热能，达到“烧死”肿瘤的目的。肿瘤的轻度热疗可降低其致密结构和组织间液压力，增加血液灌注，释放抗原，促进内源性免疫细胞的招募。Chen等[42]运用了装载吲哚菁绿（ICG）的聚乳酸-乙醇酸（PLGA）纳米颗粒，通过红外照射造成局部升温，增加了血液灌注，改变了肿瘤局部微环境，能够提高CAR-T在肿瘤局部的浸润。

此外，由于程序性死亡受体（PD-1）介导的T细胞抑制作用是肿瘤细胞逃逸的关键机制之一，联合PD-1或PD-L1抗体或阻断剂能够有效避免免疫抑制。Zah联合了BCΜA-CD319的双靶点CAR-T与PD-1阻断剂治疗，加速了体内肿瘤的初始清除率，获得治疗的持久性[43]。这种强强联合的策略，可能成为一种有效克服肿瘤进展和转移的策略。

5 结语与展望

总之，CAR-T细胞治疗恶性肿瘤还有着广阔的研究空间，虽然在血液肿瘤中的应用较为成功，但仍需解决的问题是：如何提高CAR-T治疗效力，维持CAR-T在体内的有效增殖，减少耗竭，不仅在于CAR-T的自身设计，也与肿瘤类型和免疫微环境状态息息相关。从单靶点到多靶点的演变，逐渐克服CAR-T治疗的安全性、有效性和可行性等问题，在加强自身武器的同时，通过对肿瘤微环境的调节可促进CAR-T更有效地发挥功能。随着人们对肿瘤的逐渐认知，个性化、智能化地改造T细胞，使其具有更高的靶向杀伤功能，这无疑是攻克肿瘤的有力武器。