胡明明，刘子臣，张红梅，鲁葆华，李杰，王群慧，胡范彬，林海峰，李宝兰，张同梅

0 引言

据世界卫生组织国际癌症研究机构发布的2018年GLOBOCAN报告，大约有21万新发肺癌病例和180万肺癌死亡病例[1]。在中国，肺癌是最常见的癌症，并且是癌症相关死亡的主要原因[2-3]。肺癌患者在诊断时，中位年龄约在60岁左右，45岁以下患者在高加索人群中占比不到2%，在中国约5%[4]。随着肺癌发病率上升，发病年龄也呈年轻化趋势。

目前研究发现，青年肺癌患者中女性、腺癌、不吸烟、晚期患者比例较高[5-6]。关于青年肺癌的年龄界限，目前没有一致的标准，既往研究中曾使用50、45、35岁等不同的划分标准，但多数以40岁为界限，因此本研究中选择40岁为划分标准。有研究发现，青年肺癌患者除了独特的临床病理特征以外，在基因图谱方面也不同于老年肺癌患者，有更多驱动基因的改变[7]。近年来，程序性死亡蛋白1（programmed cell death 1,PD-1）/程序性死亡蛋白配体1（programmed cell death-ligand 1,PD-L1）抑制剂在肺癌治疗中显示出良好的疗效，肿瘤细胞的PD-L1表达可以预测免疫治疗的疗效，目前尚未见青年肺癌PD-L1表达的相关数据。因此本研究以青年肺癌患者为研究对象，针对该人群EGFR突变状态、突变亚型分布和肿瘤细胞PD-L1的表达展开。

1 资料与方法

1.1 一般资料

收集2014年1月—2019年12月在首都医科大学附属北京胸科医院住院并经根治性手术切除、病理确诊为NSCLC的临床资料，包括性别、年龄、吸烟史、病理类型（包括病理亚型）、病理分期等，共纳入年龄≤40的青年肺癌患者47例，≥60岁老年肺癌患者共1 878例。术后分期根据第8版美国癌症联合会（American Joint Commitfee on Cancer,AJCC）TNΜ分期系统进行分期。病理类型根据2015年世界卫生组织肺癌诊断标准进行分类。纳入标准如下：（1）病理诊断为NSCLC患者；（2）经影像学诊断为可手术的NSCLC患者；（3）首次施行根治性手术切除，术后切缘阴性。排除标准如下：（1）含小细胞肺癌成分的NSCLC；（2）有5年内第二原发性肿瘤的病史；（3）患者在手术前接受过新辅助治疗，包括化疗、免疫治疗和靶向治疗。本研究经北京胸科医院伦理委员会批准。

1.2 方法

1.2.1 EGFR突变状态的检测 使用EGFR突变检测试剂盒（艾德生物科技有限公司，厦门，中国），检测位点包括外显子18-21的点突变（G719A、G719S、G719C、T790Μ、L858R、L861Q和S768I），三种外显子20的插入突变（20ins）和19种外显子的缺失突变（19del）。

1.2.2 免疫组织化学检测PD-L1的表达 手术切除标本用10%甲醛固定并进行石蜡包埋、切片、抗原修复、封闭后，滴加PD-L1抗体（22C3抗体，Dako公司，美国），于4℃冰箱中过夜，经二抗孵育、DAB显色、苏木精对比染色，分化、脱水、透明封片。PD-L1判读标准：PD-L1表达肿瘤比例评分（tumor proportion score,TPS）为任意强度下部分或完全膜染色肿瘤细胞的百分比，TPS＜1%为阴性，≥1%为阳性[8]。

1.3 统计学方法

倾向性评分法由3.5.2版本的R语言软件完成，采用“ΜatchIt”R包的最近邻匹配法对青年组和老年组进行1:2匹配，匹配因素包括性别、病理类型、吸烟状态，最终成功匹配老年组肺癌患者94例。数据分析应用SPSS 23.0统计软件包处理，年龄、PD-L1表达以中位数和四分位间距表示（Μ，Q1-Q3）。分类变量的比较采用卡方检验或Fisher精确检验，两样本之间连续变量的比较使用Μann-Whitney检验。P＜0.05（双边检验）为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者的基线临床病理特征

2014年1月—2019年12月收治的可手术的青年NSCLC患者共47例，随机匹配的94例老年患者的中位年龄66岁（63～69岁），详细临床病理资料见表1。将Ⅰ+Ⅱ期对比Ⅲ+Ⅳ期，可以看到，即使两组都是术前评估为可手术的NSCLC患者，青年肺癌组手术患者分期更晚（P=0.027），见表1。

表1 青年和老年NSCLC患者的临床病理特征Table 1 Baseline characteristics of young and elder NSCLC patients

2.2 青年肺癌和老年肺癌手术标本中EGFR突变情况

47例青年肺癌手术标本中有21例检测到EGFR突变（21/47,44.7%），其中12例为19del，3例为20ins，4例为L858R，1例为T790Μ，1例为L861Q。94例老年肺癌手术标本中，40例患者检测到EGFR突变（40/94,42.6%），其中，18例为19del，1例为20ins，18例为L858R，2例为G719X/S768I复合突变，1例为S768I。经卡方检验，青年和老年肺癌两组在EGFR突变率上无明显差异（P=0.545）。在EGFR突变类型的构成比方面，青年肺癌组中19del和20ins所占的比例较老年组高，分别为57.1%（12/21）vs.45.0%（18/40）和14.3%（3/21）vs.2.5%（1/40）；在老年肺癌组中，L858R比例较青年肺癌组高，为45.0%（18/40）vs.19.1%（4/21），差异有统计学意义（P=0.045），见图1。

2.3 肿瘤组织中PD-L1表达与临床病理特征的关系

141例手术切除标本中，有136例检测了PD-L1蛋白的表达，57例（41.9%）表达阳性，其中18例（13.2%）高表达（PD-L1≥50%）。PD-L1阳性表达率与年龄、性别、吸烟史、病理类型、EGFR突变无关（P＞0.05），但与淋巴结转移、肿瘤直径相关，在淋巴结转移阳性病例中PD-L1阳性率更高（P＜0.001）；瘤体直径越大，PD-L1阳性率越高（P=0.013），见表2。在5种腺癌组织学亚型（腺泡状为主型腺癌、乳头状为主型腺癌、微乳头状为主型腺癌、贴壁状为主型腺癌以及实体为主型腺癌）中比较PD-L1的表达率，发现实体为主亚型中PD-L1阳性率明显高于其他亚型（P=0.006），见表3。分析EGFR 19del和21L8585R与PD-L1阳性表达率之间的关系，结果显示在青年肺癌组中，19del组PD-L1表达为5%（0～20%），L858R组表达为0，二者差异具有统计学意义（P=0.047）；而在老年肺癌组中，19del组与L88R组PD-L1表达差异无统计学意义（P=0.602）。

表2 青年和老年NSCLC患者PD-L1表达与临床病理特征的关系Table 2 Association between PD-L1 expression and clinicopathological characteristics in young and elder groups

表3 青年和老年肺腺癌患者PD-L1表达和组织学亚型的关系Table 3 Association between PD-L1 expression and histological subtype in lung adenocarcinoma in young and elder groups

3 讨论

近年来青年肺癌以其独特的临床病理特征引起了研究者的注意。本研究纳入了47例行手术切除的年龄≤40岁的青年肺癌病例，临床特征显示女性、不吸烟、腺癌为主要特点。我们对47例手术标本进行了EGFR基因检测和PD-L1表达的研究。结果显示，青年肺癌中EGFR突变频率为44.7%（21/47），60岁及以上患者RGFR突变率为42.6%（40/94），两个队列中EGFR突变率无明显差异。Yang等团队对640例肺癌组织进行EGFR、KRAS、ALK、ROS1基因检测发现，不同年龄组间ALK、ROS1及RET等融合基因的发生率差异有统计学意义，但EGFR、KRAS等基因突变的发生率差异无统计学意义[9]。Hu等对2 544例中国肺癌标本进行了EGFR的基因检测，也发现不同年龄组的患者EGFR突变率没有明显差异[10]，但是基于SEER数据库的数据显示青年肺癌患者的EGFR突变率明显低于老年患者，种族差异或许是结果不一致的原因之一。

EGFR突变包括多种形式，主要发生于胞内酪氨酸激酶区域的18-21外显子，现已发现有30多种的突变形式。EGFR 19del和21L858R是两种最常见、且与临床疗效最为相关的敏感突变，约占所有突变形式的80%～90%。第三类最常见的突变形式是20ins，其他突变形式较为少见，包括G719A、G719S、G719C、T790Μ、L858R、L861Q和S768I[11-13]。本研究发现，在EGFR各突变形式中，L858R在老年队列中占比更高，19del和20ins在青年队列中占比更高，这与近年来的相关研究报道一致[7,10]。目前为止，尚没有研究解释19del和L858R突变发生率在人口学方面有差异的原因，尚需后续研究进行相关的探索。研究表明，19del的患者从靶向治疗中获益要多于L858患者，或许可以部分归因于19del的患者在年龄上的优势[14-15]。EGFR 20ins的发生率占所有NSCLC病例的0.1%～4%，占EGFR突变患者的1～12%[16]，本研究中老年组20ins占EGFR突变患者的2.5%，青年组中占比为14.3%，提示青年肺癌队列相较老年队列而言，虽然EGFR突变率上没有差异，但是突变形式上有不同于老年患者的特征。

近几年来，以PD-1/PD-L1抑制剂为代表的免疫治疗，极大地改变了肿瘤治疗格局，目前认为，肿瘤细胞PD-L1的表达率可以预测免疫治疗的效果。目前尚未有研究关注青年肺癌肿瘤免疫微环境方面的特点。本研究通过分析136例手术切除的癌组织标本中PD-L1表达，发现PD-L1的阳性表达率与肿瘤直径、淋巴结转移显著相关，肿瘤直径越大，淋巴结转移阳性者，PD-L1阳性率越高。Lee等、Zhao等研究发现PD-L1的表达与肿瘤大小、脑转移、淋巴结转移相关[17-18]。近年来有研究发现，肿瘤干细胞通过表达PD-L1有助于免疫逃逸；外泌体表达的PD-L1可以抑制CD4+和CD8+等免疫效应细胞的活化，诱导CD8+T细胞凋亡，从而参与肿瘤的发生和发展[19]。本研究未发现PD-L1表达率与年龄相关，但是肿瘤免疫微环境非常复杂，除了PD-L1，还有CD8+T淋巴细胞、CD4+T淋巴细胞、调节性T细胞、巨噬细胞等，还需继续探索青年肺癌在肿瘤免疫微环境方面的特点。腺癌的病理亚型，包括实体型、乳头型、微乳头型、腺泡型、贴壁型等，在所有亚型中，实体亚型和微乳头亚型与可手术NSCLC患者的预后较差有关，提示不同亚型的肺癌其恶性程度是不同的[20]。本研究针对手术标本，分析了腺癌不同病理亚型和PD-L1表达的关系，发现在实体亚型中，PD-L1阳性率明显增高，这与既往研究结果一致[21-23]。

本研究进一步分析了EGFR 19del和L858R这两种最主要的突变形式中PD-L1的表达差异。在老年组中，未观察到两种突变形式之间存在差异，但是在青年组中，19del患者PD-L1阳性率明显高于L858R患者，前者肿瘤细胞PD-L1表达中位数为5%（0～20%），而L858R组中4例患者PD-L1表达均为阴性，这是首次在青年肺癌中关注EGFR不同突变形式PD-L1表达的差异。目前相关研究主要集中于老年人群，因为肺癌的高发年龄为60岁以后，且研究结果也不一致，Jain等和Chen等发现L858R中PD-L1表达高于19del[22,24]，Song等发现19del中PD-L1表达高于L858R[25]，也有研究者发现两种突变形式之间不存在差异[26]。

本研究也存在一定的局限性，首先本研究为回顾性研究，纳入病例数量较少，其次纳入研究的患者缺乏生存随访数据，无法对后续青年NSCLC的整体预后、EGFR-TKI靶向治疗的疗效、不同EGFR突变类型患者后续免疫治疗的疗效进行后续分析，尚需继续开展相关研究来关注这一人群。