茎瘤芥（榨菜）主要品种SSR分子标记差异性研究

2022-07-29王浩沈进娟彭丽莎管中荣张召荣王彬范永红

长江蔬菜 2022年10期

王浩，沈进娟，彭丽莎，管中荣，张召荣，王彬，范永红

（重庆市渝东南农业科学院，川渝共建中国酱腌菜科技创新重庆市重点实验室，408000）

茎瘤芥（Brassica junceavar.tumida）是我国独有的特色蔬菜之一，其特点是茎部膨大并形成瘤状肉质茎（又名青菜头），是制作榨菜的原料，具有很高的经济价值[1]。目前，全国茎瘤芥种植面积20万hm2左右，主要分布在重庆、浙江、四川、湖南、湖北等14个省市区，其中，以重庆种植和加工规模最大，产品也最为集中[2]。重庆涪陵是“中国榨菜之乡”，也是全国最大的榨菜生产和加工基地，具有完整的榨菜产业链和产业化经营格局。无论是青菜头种植面积和产量，还是成品榨菜产销量，均位居全国第一[3]。

但是，茎瘤芥遗传基础较狭窄、育种种质贫乏，部分材料存在优异性状不显著和现有品种难以满足多元化市场以及规模化、自动化、智能化产业发展需求。鉴定研究育种材料遗传背景，可根据亲本间遗传距离有效利用杂种优势，辅助新品种培育及种质创新，提升品种综合性状表现，满足生产及产业发展的需要，是一种切实有效的途径。茎瘤芥种质资源的鉴定、评价、分类和遗传研究，是合理利用种质资源、选配亲本、创新材料、提高育种效率的重要基础[4]。SSR分子标记是近年来发展迅速的一种分子标记技术，具有成熟稳定、快速简便、可靠性强、重复性高且品种间多态性丰富的特点，被广泛应用于遗传多样性分析[5]。

因此，为进一步鉴定研究茎瘤芥主要品种的差异性，本研究利用9对SSR标记对茎瘤芥品种进行荧光标记检测，通过构建品种分子身份证和分析品种的遗传多样性，为茎瘤芥品种资源的鉴定、亲缘关系分析、遗传基础研究等工作提供依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

从茎瘤芥国家登记品种中随机选取在重庆与浙江两地大面积推广应用的6个品种作为试验材料。其中重庆品种有涪杂2号、涪杂5号、永安小叶；浙江品种有甬榨1号、甬榨4号、甬榨5号。2021年9月1日播种，采用穴盘育苗的形式，置于重庆市渝东南农业科学院温室大棚内进行常规肥水管理。

项目组在前期在SSR标记相关研究工作中，获得了一批多态性引物（表1），2022年1月选择其中9对条带清晰、表现稳定的多态性引物用于样品扩增，正向引物5'端添加荧光标记，所用引物均由上海思兴生物科技有限公司合成。

表1 引物信息

1.2 DNA提取与PCR扩增

植株生长到第6片真叶时，取第5片真叶，采用改良CTAB法或使用植物专用DNA提取试剂盒，将每个参试品种的50片第5片真叶混合提取DNA。使用紫外分光光度计检测样品DNA质量和浓度，并稀释至50 ng/μL，-20℃保存备用。

PCR扩增采用2×PCR Mix体系扩增，按照表2进行配制（反应体积20μL）。

PCR反应程序为：95℃变性5 min，1个循环；95℃变性30 s，50℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环；60℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环；72℃延伸10 min，16℃保存。

表2 PCR扩增反应体系

表3 9对SSR引物标记的扩增结果

1.3 SSR荧光标记毛细管电泳检测

配制HiDi＋Liz混液（1板量）：HiDi 900μL＋Liz 15μL混匀；按分好的引物组合混panel，每个孔吸取3μL扩增好的样品，然后加2倍水稀释；吸取2μL混液到上样板中，每个孔加9μL HiDi＋Liz混液，95℃解链5 min；冷冻10 min，离心1 min。连接毛细管电泳仪ABI3730XL进行电泳分析，待毛细管电泳检测完毕，利用SSR指纹分析器处理后获得原始数据。

1.4 分子身份证构建

利用9对条带清晰、表现稳定的SSR多态性引物对6个茎瘤芥品种样品进行扩增，获得参试样品的指纹数据，再将其转换为数字代码，即分子身份证。

转换方法如下：将每对引物在某一样品上扩增出的每1种带型用阿拉伯数字1～9编码（为保证每1种带型只占一位数字，当带型数大于9时，分别用a、b、c代表第10、11、12种带型，依此类推，无带用0表示）。按照引物带型种类由少到多的顺序，将每个样品在9对引物上的扩增带型编码串联起来，即得到每个样品以9位数字（或字母）表示的分子身份证[6]。

2 结果与分析

2.1 SSR标记毛细管电泳结果

如表3、4所示，6个茎瘤芥品种样品共筛选到7对SSR多态性引物，检测到20个等位位点，平均每对引物2.2个等位位点；共扩增得到20个带型，平均每对引物2.2个，扩增片段长度在126～397 bp（其中S5、S7在6个样本中的带型表现一致，无多态性）。

表4 9对SSR引物的扩增带型

表5 供试品种的分子身份证编码

茎瘤芥为异源四倍体植物（AABB），共36条染色体（2n=36）。测序结果显示7对SSR引物标记分别位于茎瘤芥6条不同染色体上，且A、B染色体分布相当（表3）。

综上所述，SSR引物多态性良好，在茎瘤芥染色体中分布较均匀。

2.2 供试品种的分子身份证构建

按照表4所示的引物顺序，将每对引物在不同样品上扩增得到的带型排列并将其编码进行串联，即得到6个茎瘤芥主要品种的分子身份证（表5）。对应位置编码相同则表明该引物在不同样品上获得了相同的扩增条带。结果表明，6个参试的茎瘤芥主要品种的分子身份证代码各有差异。通过构建分子身份证代码，将供试的6个茎瘤芥主要品种进行了合理区分。

对构建好的茎瘤芥品种的身份代码比对分析发现，6个茎瘤芥品种间平均差异位点3.7个，其中浙江本地品种间平均差异位点5.3个，浙渝两地品种间平均差异位点4.0个，重庆本地品种间平均差异位点1.3个。

3 结论与讨论

3.1 结论

①通过对样本扩增条带分析，从9对SSR芸薹作物公共引物中筛选到7对多态性引物，并且在茎瘤芥染色体中分布较均匀。6个茎瘤芥品种中共检测到20个等位位点，平均每对引物2.2个；共扩增得到20个带型，平均每对引物2.2个，扩增片段长度在126～397 bp。引物S5、S7、S12、S16、S39、S20均表现为纯合位点；引物S50、S15既有纯合位点，又有杂合位点；引物S49均表现为杂合位点。其中引物S5、S7无多态性，后期仍需增加更多品种或榨菜种质资源进一步验证分析。

②本研究利用SSR荧光标记毛细管电泳检测技术构建了6个茎瘤芥主要品种的分子身份证，各品种均拥有独立代码，能够对参试品种进行合理区分。

③对6个茎瘤芥品种的SSR标记差异分析结果表明，在分子水平上浙江本地品种间差异最大，平均差异位点5.3个；浙渝两地品种差异次之，平均差异位点4.0个；重庆本地品种间差异最小，平均差异位点1.3个；6个茎瘤芥品种间平均差异位点3.7个。研究结果为茎瘤芥品种资源的鉴定、亲缘关系分析、遗传基础研究等工作提供了依据。

3.2 讨论

①SSR引物在不同作物、不同种属间有一定的通用性[7，8]，并且随着不同作物全基因组测序工作的广泛开展，各大主要及非主要农作物SSR引物信息的公共数据库相继建成和不断更新，在很大程度上克服了SSR引物开发困难、成本高的限制。但是SSR分子标记应用于种质鉴定过程中，多方面配套技术仍需进一步改进，以提高种质鉴定效率及可靠度[9]。

②本研究使用的引物根据芸薹作物（http://www.brassica.info）公布的十字花科共同引物中筛选获得，在后面的研究中应充分利用基因组学和生物信息学筛选或设计新的特异性SSR引物，克服茎瘤芥特异性的引物缺乏难题，加快探明茎瘤芥的遗传进化背景，挖掘与定位茎瘤芥膨大、抽薹、抗病等重要功能基因，建立及完善茎瘤芥分子辅助育种技术等研究工作进程。

③通过SSR分子标记辅助育种，可以鉴定与了解茎瘤芥种质资源的遗传基础及亲缘关系，能够为茎瘤芥杂交组合配制的优化提供科学可靠的理论支撑。通过构建6个茎瘤芥主要品种的分子身份证，一定程度上显示出茎瘤芥品种丰富的遗传多样性。同时本研究结果能够为茎瘤芥登记品种分子数据库的构建、茎瘤芥品种真实性与纯度的鉴定提供科学依据，保证茎瘤芥种子生产、经营的有序健康发展。

④本研究筛选的引物与样品量较少，试验结果局限于7对SSR引物对6个茎瘤芥主要品种的差异性研究，今后应继续深入研究更多茎瘤芥品种及种质资源的遗传多样性，以期为整个榨菜产业体系的持续健康发展提供强有力的科学理论支撑。