张志勇，程 伟，陈兴杰，杜先锋，潘天全，杨金玉，李 增，高志远

(1.安徽金种子酒业股份有限公司，安徽阜阳 236023；2.安徽农业大学茶与食品科技学院，安徽合肥 230036)

白酒是具有2000多年历史的蒸馏酒，在中国传统文化、食品及经济方面都占有重要的地位。中国白酒主要有12 种风味类型，其中清香、浓香、酱香及米香是4 种基本香型。清香型白酒因具有明显的花香和果香、口味自然醇和、爽口回甘等特点，深受消费者的喜爱。大曲清香型白酒以高粱等粮谷为原料，低温大曲为糖化发酵剂，发酵菌种来源于酿造环境中自然存在的各类微生物，采用固态地缸发酵，经原料蒸煮、酒精发酵、淀粉糖化、制曲、原料处理、蒸馏取酒、陈酿及勾兑调味等工序制成。由于清香型白酒的开放式发酵方式，使其酿造体系的菌种多样化，产生的香气成分相对复杂。研究表明，白酒的挥发性成分中存在多种健康因子，包括酚类、酸类、酯类、含硫化合物等，使其具有抗氧化、保肝护肝、抑制胆固醇的合成、促进新陈代谢等功能。因此，了解白酒中特殊的挥发性组分成为重要的研究热点。

对白酒中丰富多样的风味物质进行分离和浓缩等预处理，是进行后续挥发性物质分析的重要步骤。顶空固相微萃取（Headspace-solid phase microextraction,HS-SPME）适用于多种样品的挥发性或半挥发性物质的分析；HS-SPME 还可与其他技术相联用，包括全二维气相色谱-飞行时间质谱仪（Comprehensive two-dimensional gas chromatography-time of flight mass spectrometry,GC×GC-TOFMS）。HS-SPME-GC×GC-TOF-MS技术具有峰容量大、分辨率高、分析时间短等显著特点，已经在白酒风味分析中得到应用。杨波等运用HSSPME-GC×GC-TOF-MS 技术鉴定出汾酒中含有358 种香气化合物，241 种健康功能组分；YAO 等应用该技术鉴定了泸州老窖白酒的风味成分，发现了24 种具有生物活性的化合物，确定了泸州老窖白酒中可能的特殊风味化合物来源，表明GC×GCTOF-MS 技术在白酒微量组成分析方面有明显的优势。

香气特征是白酒品质的重要组成部分，挥发性组分是构成大曲清香型白酒独特香气的重要部分，研究特征香气组分对调控大曲清香型白酒的品质具有重要意义。HS-SPME 结合GC×GC-TOF-MS技术的发展与应用，为鉴定大曲清香型白酒中的挥发性香气组分提供了方法与设备条件。本实验采用顶空固相微萃取联合全二维气相色谱-飞行时间质谱（HS-SPME-GC×GC-TOF-MS）技术分析大曲清香型白酒的挥发性香气组分，该研究为大曲清香型白酒的香气组分分析与感官特征评价提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂及仪器

实验酒样：大曲清香型白酒（原酒），优级酒（酒精度65.2 %vol，以下简称DQB），由安徽金种子酒业股份有限公司提供。

实验耗材：超纯水由Mili Q 纯水仪制备(Milli-Q 系统，Millipore，Badford，MA，USA)；2 cm 50/30 μm 固相微萃取三相头divinylbenzene/carboxen/poly(dimethylsiloxane)(DVB/CAR/PDMS)，上海Sigma-Aldrich 贸易有限公司；无水硫酸钠（化学纯）、氯化钠（化学纯）等，中国医药集团化学试剂有限公司。

分析仪器：GC×GC-TOF-MS(Pegasus4D Leco Corporation，USA)系统：Agilent 气相色谱仪（型号：7890A），美国LECO 飞行时间质谱联用仪（型号：Pegasus 4D）；GC×GC 柱系统：第一维柱：DB-WAX(30 m×250 μm×0.25 μm)，第二维柱：DB-17MS(2 m×100 μm×0.10 μm)，两根色谱柱通过毛细管柱连接器以串联方式连接。

1.2 实验方法

HS-SPME 方法：用去离子水将DQB 的酒精度稀释到10%vol，取5 mL 稀释酒样加至20 mL 顶空瓶中，加盖密封。采用DVB/CAR/PDMS 纤维头对顶空瓶中的样品进行萃取，置于50 ℃水浴恒温15 min 后，萃取30 min，随后将纤维头立即插入GC进样口，250 ℃解吸附5 min，再进行GC×GC-TOFMS分析，相同条件下进样3次。

GC×GC-TOF-MS 方法：第一维柱进样温度250 ℃，初始温度40 ℃，保留5 min，以5 ℃/min升温至220 ℃，以20 ℃/min升温至250 ℃，保留2.5 min；氦气(99.9999 %)1.0 mL/min，无分流；第二维柱的柱温较第一维柱高5 ℃，调制解调器温度始终保持高于第二维柱5 ℃，全二维分析调制周期4.0 s，接口温度270 ℃，离子源温度250 ℃，电子轰击源70 eV，检测器1680 v，采集率50 张/s，质谱扫描范围m/z 29～500，采用NIST谱库。

质谱条件：EI 离子源，电压70 eV，离子源温度230 ℃，传输线温度280 ℃；检测器电压1365 V，采集质量数范围35～500 amu、频率100 spectrum/s，数据采集由LECO公司Pegasus4D工作站控制。

1.3 数据处理

由LECO 公司Chroma TOF 工作站对采集的TOF-MS 数据进行处理，自动识别信噪比大于50的色谱峰，并自动比对质谱库。采用NIST 14 和Wiley 9 质谱库，自动比对“峰表”，经人工解谱与同系物二维色谱出峰规律比对，作为初步鉴定结果。去除烷烃类等没有风味贡献的化合物，选择相似度与反相似度均大于700，可能性大于4000 的化合物。在Chroma TOF 工作站中建立保留指数计算方法，确定化合物一维色谱柱保留指数，与文献报道的保留指数比对，再选择数值差异在50 以内的化合物作为最终鉴定结果。

2 结果与分析

2.1 HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 法应用于DQB挥发性组分分离的特性分析

白酒中除乙醇和水以外，微量成分主要有醇类、醛类、酸类、酯类、含氮化合物以及其他成分，白酒中的挥发性香气组分较为复杂，种类多样，性质各异。全二维气相色谱采用连续调制的方式，将第一维色谱柱中分离的组分转移到第二维色谱柱中进行进一步分离，有利于实现复杂组分的有效分离。根据被分离样品的特点,GC×GC 系统的第一维柱子起到主要分离作用，是对极性组分有较好分离能力的极性柱子。厚液膜、中等极性的柱子可以将第一维流出的结构相近的组分在第二维平面上实现较好的分离。

综上，本实验的GC×GC 柱系统采用DB-WAX(30 m×250 μm×0.25 μm)作为第一维柱，DB-17MS(2 m×100 μm×0.10 μm)作为第二维柱，两根色谱柱通过毛细管柱连接器以串联方式连接。如图1 所示，全二维气相色谱图表明DQB 中存在复杂的挥发性香气组分，经过GC×GC 系统，DQB 中复杂组分得到了一定程度的分离，但是也存在组分的共流出现象，其色谱分离条件还有待于进一步优化。

图1 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS分析的1D总离子流色谱图与2D总离子流色谱图

2.2 DQB 挥发性组分的HS-SPME-GC×GCTOF-MS鉴定

大曲清香型白酒的酿造工艺主要包括制曲、润糁、发酵、蒸馏等，进行“清蒸”处理后的高粱和辅料摊凉后再添加低温大曲，入缸密封发酵结束后经过固态蒸馏得到原酒。酿造过程中，首次蒸馏后的酒醅加入低温大曲进行二次发酵，再次蒸酒后作为丢糟，其酿造工艺特点可归纳为“清蒸清烧、地缸发酵、清蒸二次清”等，主体香是乙酸乙酯和乳酸乙酯等组分。杜艳红等采用DI-SPME、LLE前处理方法结合GC-MS定性方法，在红星二锅头（大曲清香型）白酒中鉴定出138 种化合物。如表1 所示，本实验采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 技术在DQB中共检测到可信度较高的挥发性组分251 种，包括56种酯类、54种醇类、38种酸类、30种醛酮缩醛类、6 种含硫化合物、6 种含氮化合物、21 种呋喃类、20种芳香族类及20种其他类型化合物。

表1 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在DQB中分离鉴定的化合物统计

酯类化合物在大曲清香型白酒中起主要呈香作用，乙酸乙酯作为特征性的香气组分，其含量决定了不同品牌清香型白酒的香气特点和感官特征。清香型白酒“口微甜、刺激性较强、带有一定的爽口苦味”等口感与醇类化合物的含量及比例有重要关系。酸类物质对各香气成分起到较好的协调、平衡等作用，能够增加酒体的醇厚感；酸类物质也是新酒老熟的重要催化剂，对香气具有一定的抑制和掩蔽作用。醛类物质虽然多但相对含量并不高，但是对清香型白酒的香气具有较大的贡献。由于呋喃类、芳香族及含硫化合物通常具有特殊香气，可能对DQB 的香气产生重要影响，因而，本文在鉴定出的挥发性香气组分中着重对比分析了呋喃类、芳香族及含硫化合物。

2.2.1 呋喃类化合物

呋喃类化合物在白酒中的含量相对较低，研究表明呋喃类化合物是酱香型白酒的重要呈香物质和特征化合物。如表2 所示，在DQB 中检测到21种呋喃类化合物，其中的2-戊基-呋喃具有果香、青香及豆香，乙酸糠醛具有药香、辛香。在豉香型白酒中也检测到2-甲基呋喃、2-乙基呋喃、2-戊基-呋喃及糠醛等特殊香气物质。苯并呋喃是本实验中检测到的另一重要化合物，具有特殊香气，并具有多种生理活性，如抗肿瘤活性、抗氧化、抗菌等。DQB中检测到的乙酸糠醛、苯并呋喃等呋喃类化合物，可能对DQB 独特的香气形成及人体健康具有积极影响，可作为DQB 的重要香气组分。

表2 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在DQB中鉴定出的呋喃类化合物

呋喃类化合物在清香型白酒中的含量相对较低，可能对清香型白酒风味的贡献较小，相关研究文献也较少；因此，需要深入研究呋喃类化合物在清香型白酒香气组分中发挥的作用。酿酒大曲和酒醅是酒体中呋喃类化合物的重要来源，酿酒工艺及蒸馏环境也是影响酒体中呋喃类化合物种类和含量的重要因素。综上，乙酸糠醛、2-戊基-呋喃、苯并呋喃等具有特殊香气的呋喃类化合物及其与其他香气组分的相互作用，可能对DQB 的香气产生重要影响。

2.2.2 挥发性含硫化合物

白酒中含有的挥发性含硫化合物一般由含硫氨基酸转化而来，具有香气阈值低的特点，能赋予白酒独特的香气。含硫化合物具有热不稳定性，极易发生氧化反应，例如，二甲基硫、甲硫醇可氧化成二甲基二硫和二甲基亚砜等。如表3 所示，本实验在DQB 中共检测到6 种含硫化合物，其中，甲硫醇具有腐烂的卷心菜气味，二甲基三硫具有洋葱味，二甲基二硫具有洋葱和白菜香味，在五粮液、剑南春、今世缘、汾酒等多种品牌白酒中均检测到相关的几种挥发性含硫化合物。在DQB 中检测到的甲硫醇等挥发性含硫化合物会让人产生不愉快的感觉，某些特殊的含硫化合物还可能对白酒香气产生消极影响；因此，对含硫化合物的研究有助于进行DQB的品质调控。

表3 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在DQB中鉴定出的含硫化合物

挥发性含硫化合物对清香型白酒的风味有较大影响，是鉴定白酒缺陷的重要指标，可能对清香型白酒的香气具有消极影响，或者影响其“清香醇正”的口感。大曲清香型白酒的酿造采用低温大曲与“两遍清”工艺，其制曲温度与粮醅发酵温度都较低，发酵过程中的霉菌及适宜中低温的细菌菌群较为丰富；因而，其酒体中酯类和含硫化合物的含量与种类明显较低，酒体主要突出乙酸乙酯的花草香气，表现为“酒体醇净”。

2.2.3 芳香类化合物

芳香类化合物是白酒中重要的呈香物质，大多数的芳香族化合物呈幽雅的花香、水果香和甜香，具有香味突出且阈值低、沸点高、难挥发等特点，酒体的“优雅、醇厚”等风味特点的形成与芳香族化合物有着重要的关系。如表4所示，本实验在DQB中共检测到20 种芳香类化合物，其中苯甲醛、苯乙醛、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯、苯甲酸乙酯、苯乙醇在多种品牌白酒中被检测到。研究表明，苯甲醛具有杏仁香味，苯乙醛具有植物花香，苯甲酸乙酯具似蜂蜜香味，苯乙酸乙酯具玫瑰香和蜂蜜香，苯丙酸乙酯具水果香味。综上，苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯等具有特殊香气的芳香族化合物，可能对DQB的香气起到重要作用。

表4 基于HS-SPME-GC×GC-TOF-MS法在DQB中鉴定出的芳香族化合物

白酒中芳香族化合物的代谢途径一是原料中的单宁、木质素、阿魏酸、香草醛经微生物发酵生成，二是在制曲时形成中间产物，微生物发酵生成并且在发酵过程中相互转化。大曲清香型白酒在酿造过程中自然网罗了多种微生物，微生物在持续发酵过程中会产生丰富的酶系。酿酒原辅料中固有的挥发性物质一部分可直接随着蒸馏工艺进入原酒中，一部分则在发酵过程中转化为其他挥发性成分；因此，原料和微生物是DQB 等白酒中香气成分复杂的重要原因。

3 结论与讨论

白酒酿造过程中的原料、制曲、发酵容器及地域环境等因素对酿造微生物种类及代谢具有重要影响，进而形成不同的特征性挥发性组分，直接影响白酒的香型和品质。大曲清香型白酒在酿造过程中所形成的微生态环境，主要包括大曲微生物、酒醅微生物以及环境微生物的相互作用及影响，进而产生具有独特香气的风味化合物，使其酒体具有“清、爽、绵、甜、净”等典型的感官特征。对复杂酿酒微生物之间的相互作用以及交叉代谢等过程，以及产生风味物质的途径等还需要深入研究，明确微生物菌群的代谢途径、风味物质的形成机制等是提高白酒品质与风味的重要前提，其中样品前处理方法及风味检测设备与技术的不断进步发挥着重要作用。

DQB 的香气感官特征是多种挥发性香气组分综合呈香作用的结果，本实验采用HS-SPME-GC×GC-TOF-MS 技术对DQB 进行挥发性香气组分分析，结果表明：（1）在DQB 中共检测到可信度较高的挥发性组分251种，包括56种酯类、54种醇类、38种酸类、30 种醛酮缩醛类、6 种含硫化合物、6 种含氮化合物、21 种呋喃类、20 种芳香族类及20 种其他类型化合物；（2）DQB 中鉴定出的多种特殊挥发性香气组分，如乙酸糠醛、2-戊基-呋喃、苯并呋喃、苯乙酸乙酯等，尤其是苯甲酸乙酯、苯乙酸乙酯、苯丙酸乙酯等芳香族化合物，可能对大曲清香型白酒的香气起到重要作用。本该研究为大曲清香型白酒的香气组分分析与感官特征评价提供依据。