曹忠君

（铁岭市畜产品安全检测站，辽宁 铁岭 112000）

在现代化畜牧业养殖过程中，普遍存在着用于提高经济动物产品产量的药物及违禁品被广泛滥用的现象，盐酸克伦特罗就是其中最常用的一种。它属于拟肾上腺素类药物，被人们意外发现盐酸克伦特罗可明显促进经济动物生长，显著提高瘦肉率。能够促进动物肌肉生长，特别是机体蛋白质的合成，阻碍脂肪的形成，从而改善肉品质，所以盐酸克伦特罗又称为“瘦肉精”。大量试验证明，盐酸克伦特罗在动物体内蓄积残留的主要器官和组织是，肝、眼睛、肌肉、肺、毛发、肾和脂肪组织。药物残留对环境、人体健康、畜牧业健康发展等方面影响极大。近年来，我国政府及相关部门对兽药的科学用药和残留检测极为重视，因此应重视对盐酸克伦特罗的检测。

本研究旨在探讨应用酶联免疫法检测猪尿中克伦特罗残留的方法，同时也为了监测某地区屠宰的生猪克伦特罗残留的现状。结果表明，该方法具有快速、简单、准确、检测成本不高的特点，本次试验检测数据全部合格。本方法适用于大批量检测，便于基层检测机构以及屠宰企业应用，能够起到监测经济动物药物使用情况的作用。

1 材料与方法

1.1 仪器和设备

DNM9602G型酶标分析仪(配备450纳米滤光片)；CF160RXⅡ型高速立式冷冻离心机；恒温培养箱（可调至25℃）；可调式移液器（规格为50微升、300微升、1000微升）；八道移液器（规格为300微升）；移液器吸头50微升、300微升、1000微升；吸水纸。

1.2 试剂和材料

除应具有实验室常用玻璃器皿和实验用水（应符合GB/T 6682中一级水的要求）外，还应准备克伦特罗酶联免疫试剂盒，应保存于2～8℃冰箱中，试剂盒应包括如下试剂耗材。

（1）96孔板(12条×8孔)包被有针对克伦特罗IgG的包被抗抗体。（2）克伦特罗系列标准品样液(至少有5个倍比稀释浓度水平，附加1个空白对照)。（3）克伦特罗抗体(浓缩液)和过氧化物酶标记物(浓缩液)。（4）发色剂（四甲基联苯胺）和酶底物（过氧化尿素）。（5）缓冲液（酶标记物及抗体浓缩液稀释用）和反应终止液（1摩尔/升硫酸）。

竞争酶标记物的稀释：提供的竞争酶标记物为浓缩液。由于稀释的酶标记物不稳定，仅需稀释实际用量的酶标记物。用缓冲液以1∶10的比例稀释酶标记物浓缩液(如400微升浓缩液+3.6毫升缓冲液，足够4个微孔板条32孔用)。

克伦特罗抗体的稀释：克伦特罗抗体浓缩液稳定适合长期放置，由于稀释的克伦特罗抗体稳定性变差，仅需稀释实际需要用量的克伦特罗抗体即可。用缓冲液以1∶10的比例稀释抗体浓缩液(如400微升浓缩液+3.6毫升缓冲液，足够4个微孔板条32孔用)。

包被有抗抗体的微孔板条的使用：将锡箔袋沿横向边压皱外沿剪开，取出需用数量的微孔板放置在框架上，将剩余的微孔板放进原锡箔袋中并且与提供的干燥剂一起重新密封，保存于4℃冰箱中。

1.3 方法

样品制备：尿液清澈可直接上样，若浑浊先离心(5000转/分钟)10分钟，备用。

试验步骤：（1）使用前使试剂和材料恢复到室温。（2）将标准和试样所用数量的孔条插人微孔架。（3）加入100微升准确稀释好的抗体溶液到每一个微孔中，充分混合并在室温（或放置25℃培养箱中）孵育15分钟。（4）倒出所有孔中的液体，倒置在吸水纸上拍打(每行拍打4次)，用力应均匀，防止用力过大甩出孔条。用250微升实验用水充入孔中，轻轻摇晃后倒出微孔中液体，再重复操作3遍以上。（5）加入20微升的处理好的尿液或标准到微孔中，试样和标准至少做两个平行实验。（6）加入100微升已经稀释过的酶标记物，25±2℃孵育30分钟。（7）全部倒出孔中的混合液体，在吸水纸上拍打(每行拍打4次)。用250微升实验用水充入孔中，倒出微孔中液体，再重复操作3次以上。（8）迅速加入50微升酶底物和50微升发色试剂到微孔中，室温孵育15分钟。（9）加入100微升停止液到每个微孔中，尽快在450纳米波长处的酶标分析仪测量，微孔加停止液后为深浅不同的黄色，颜色越浅表示克伦特罗含量越高。

结果计算：

先计算相对吸光度值。按下式计算：

相对吸光度值(%)=B/B×100

式中：

B——标准(或试样)溶液的吸光度值；

B——空白(浓度为0的标准溶液)的吸光度值。

式中：

——试样中克伦特罗的含量，单位为微克每千克(或微克每升)。

——试样吸光度值(%)对应的克伦特罗量，单位为微克每升。

——试样的稀释倍数。

——试样的取样量，单位为克(或毫升)。

2 结果与分析

2.1 标准曲线分析

由图1可以看出相关系数R=0.9998，表明吸光度和克伦特罗含量浓度线性相关性高，标准品使用准确，酶标分析仪性能正常、调试良好。

图1 酶联免疫法测定克伦特罗含量标准曲线

2.2 方法回收率分析

本研究共进行10次实验，为了保证检测的准确度，每次实验附带一批次空白样品和两批次质控样品，添加回收浓度为，1微克/升和2微克/升，其回收率均在74.3%～109.7%，说明尿液中克伦特罗成分损失小，酶联免疫试剂盒试剂材料有效，检测方法、实验操作步骤正确，测试数据准确、真实。

2.3 样品结果分析

检测结果显示，从某地区不同屠宰场随机抽取的100批次猪尿样品中克伦特罗含量均未超过酶联免疫试剂盒检出限，合格率为100%。

3 讨论

酶联免疫法检测药物残留成本低、特异性高，适合大批量样品检测，实用性强。笔者根据检验检测工作多年经验，总结以下几点该检测方法操作注意事项供基层检测机构和屠宰企业检测人员参考：（1）当今酶联免疫试剂盒生产厂家很多，应加以考察和质量验证，使用质量符合要求的产品。（2）每次实验都应同时做空白对照和阳性添加对照，做好质量控制，且做平行样品。

（3）完全按照其步骤操作，不可省略、颠倒步骤。（4）试剂盒使用前，将试剂盒内各组份置于室温，待其恢复至室温（25±2℃），方可使用。使用后请立即将试剂及包被有抗抗体的微孔板条放回 2～8℃冰箱中保存，但也不要反复恢复室温再冷藏（一般建议酶联免疫试剂盒3次实验内用完），否则吸光度值下降，数据准确度下降。（5）各试剂在使用前需摇匀，浓缩液一定注意稀释后使用。（6）检测时，应尽量减少板孔上方空气流动，加入试剂应迅速且准确。（7）不同标准品、样品所用吸头不得混用，防止污染及反应。（8）移液器吸取试剂时应避免出现气泡，否则试剂加入量不准确，有气泡应推出液体重新吸取。（9）终止液中含有硫酸，使用时防止灼伤皮肤及腐蚀衣物。