于学文 孙立新 马聚珂 李小芹 尹义强 刘善凤 巩若箴

下咽癌及喉癌是头颈部恶性肿瘤之一，其中大 部分为鳞状细胞癌，因其发病位置隐蔽，早期患者症状不明显，且易发生颈部淋巴结转移，患者确诊时常为晚期，预后极差[1]。近年来学者研究表明，在肿瘤细胞的生长、增殖、迁移及凋亡过程中Ki-67 抗原发挥着重要作用，Ki-67 表达水平高低反应着肿瘤细胞的分化程度、浸润转移能力，目前Ki-67 抗原已被广泛应用于测定多种恶性肿瘤增殖活性的重要指标[2-4]，Ki-67 表达阳性率越高，肿瘤细胞处于增殖周期的细胞越多，肿瘤增殖越快，其侵袭性越强[5-7]。由于下咽癌及喉癌患者不同临床分期，影响其治疗方案的选择及预后情况[1，8]。本研究旨在探讨下咽癌及喉癌中Ki-67 表达情况与肿瘤分期（TNM）的相关性，为下咽癌及喉癌患者个体化、精准化治疗及预后提供支持。

资料与方法

1 一般资料

以2019 年2～12 月在本院收治的35 例下咽癌及喉癌患者为研究对象，患者均为男性，年龄46～79岁，平均（61.7±7.6）岁。下咽癌患者临床症状多表现为吞咽异物感及梗塞感、吞咽疼痛，伴有进行性吞咽困难；喉癌患者临床症状多表现为声嘶、呼吸困难等；患者发生颈部淋巴结转移时可出现颈部包块。本研究制定纳入标准为：①所有下咽癌及喉癌患者均经病理学证实；②所有下咽癌及喉癌患者均有肿瘤分期；③所有下咽癌及喉癌患者均检测Ki-67 表达情况；④所纳入患者均未进行放化疗等相关治疗；⑤排除由其他肿瘤侵犯或转移。

2 Ki-67 表达情况评判标准

HE 染色：蜡块以4μm 的厚度进行连续切片，放入60℃恒温箱中烤片2h，以防脱片。切片浸入二甲苯脱蜡、梯度酒精水化，苏木素染色5min，水洗后1%盐酸酒精分化，1%氨水返蓝，0.5%伊红染色1min，常规脱水、透明、封片。

免疫组化染色：采用EnVision 两步法。常规组织石蜡切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精水化；经EDTA（pH8.0）缓冲液高压锅煮沸1min 进行抗原修复处理，冷却至室温，PBS 冲洗；3%H2O2室温下孵育10min，PBS 冲洗；滴加Ki-67 单克隆抗体后置于37℃恒温箱中孵育60min，PBS 冲洗；滴加抗小鼠/兔IgG 过氧化物酶聚合物，室温孵育30min；滴加新鲜配制的DAB 显色液，室温孵育5～10min；苏木素复染、脱水、透明、封片。

由2 位经验丰富的病理科医师采用双盲法阅片。免疫组织化学染色采用链霉菌抗生物素蛋白-过氧化物酶连结法（Streptavidinperosidase, SP），当肿瘤细胞的胞浆内出现清晰的棕黄色颗粒时判定为Ki-67 表达阳性。每张切片通过光镜选择10 个典型高倍视野（×400），每个视野计数100 个细胞，计算各视野内的阳性细胞数与细胞总数百分比的平均值百分率作为Ki-67 表达指数。

阳性细胞百分率（N）分为4 个等级：“N=0”为阴性（-），“0＜N≤25%”为弱阳性（+），“25%＜N≤50%”为中度阳性（++），“50%＜N≤75%”为高度阳性（+++），“N＞75%为强阳性（++++）。

3 统计学方法

本研究利用SPSS 13.0 统计学软件进行相关数据统计处理，计量资料采用均数±标准差表示；进行Spearman 相关性分析，并对有统计学意义者进行受试者操作特征曲线（ROC）分析，评估其预测效能，确定诊断阈值，并计算曲线下面积、敏感度、特异度。P＜0.05 认为差异具有统计学意义。

结果

根据纳入标准，本研究共纳入35 例下咽癌及喉癌患者，其中下咽癌患者23 例，喉癌12 例，根据肿瘤TNM 分期（T 指原发肿瘤范围，N 指区域淋巴结是否转移及范围，M 指远处转移是否存在）：T1期1 例，T2期10 例，T3期13 例，T4期11 例；N0期11例，N1期2 例，N2期10 例，N3期12 例；所纳入研究患者均为M0期。

Ki-67 表达百分率与肿瘤TNM 分期中T 分期无明显相关性（P=0.600）；Ki-67 表达等级与肿瘤TNM 分期中T 分期无明显相关性（P=0.958）。Ki-67表达指数与肿瘤TNM 分期中N 分期存在相关性（P=0.017），相关系数为r=0.402；Ki-67 表达指数≥0.6 时，区域淋巴结发生转移灵敏度及特异度分别为60%、90%，ROC 曲线下面积0.75（0.58～0.93）（图1）。Ki-67 表达等级与TNM 分期中N 分期存在相关性（P=0.004），相关系数为r=0.478；Ki-67 表达等级≥3 级时，区域淋巴结发生转移灵敏度及特异度分别为60%、80%，ROC 曲线下面积0.72（0.54 ～0.85）（图2）。

图1 Ki-67 表达指数预测淋巴结转移的ROC

图2 Ki-67 表达等级预测淋巴结转移的ROC

讨论

恶性肿瘤增殖活性与细胞调亡及细胞周期相关调节机制密切相关，完整的细胞周期及细胞增殖过程与其调控表达明显相关。细胞不可控性增殖、分裂是肿瘤恶性程度的重要依据，Ki-67 增殖抗原可以敏感反应细胞增殖活性，研究显示肿瘤恶性度随着Ki-67 增殖抗原表达指数的增高而增高，因此，Ki-67 增殖抗原表达水平的检测对于肿瘤生物活性的评估至关重要[9]。

Ki-67 是核增殖抗原，Ki-67 增殖抗原在细胞处于静止和休眠期并不表达。近年来，学者研究发现Ki-67 增殖抗原在喉癌及下咽癌中高表达[3，4，9，10]，我们的研究显示Ki-67 增殖抗原在喉癌及下咽癌中过度表达，35 例下咽癌及喉癌病人中29 例(82.9%)高表达。虽然Ki-67 增殖抗原在细胞分裂过程中的确切机制未明，但是它的表达与细胞的增殖具有一致性，若是阳性则表明细胞增殖活跃。

本研究采用免疫组化染色法检测下咽癌及喉癌组织中Ki-67 增殖抗原的表达水平，发现Ki-67增殖抗原的阳性表达主要位于下咽癌及喉癌组织细胞核内，呈现为棕黄色颗粒，正常组织中没有发现Ki-67 增殖抗原表达。目前Ki-67 表达水平与肿瘤临床病理分期的研究结果不一致，仍存在一定争议。Vukelic 等[11]认为Ki-67 表达水平与肿瘤组织学分级呈显著正相关，Ki-67 表达与肿瘤的诊断、分期及治疗结果无关，Ki-67 在喉癌中的表达不是准确诊断和预测临床病程的最可靠指标。钟伟铭等[12]认为Ki-67 表达在鼻咽癌中高表达，但是Ki-67 表达水平与鼻咽癌的临床分期无关。杨萍丽等[13]认为Ki-67 表达水平与鼻咽癌的临床分期、肿瘤组织学分级相关，Ki-67 表达水平与淋巴结转移无关，P27表达与Ki-67 表达呈负相关，CyclinD1 表达与Ki-67 表达呈正相关。郭珍珍等[14]认为Ki-67 表达水平与喉癌患者2 年内复发、无病、生存期的长短及肿瘤临床分期均不相关。本研究经Spearman 统计学分析发现，Ki-67 增殖抗原表达与下咽癌及喉癌患者肿瘤TNM 分期中T 分期无关，与肿瘤TNM 分期中N 分期具有显著相关性，而且Ki-67 表达水平越高，提示肿瘤越易发生区域淋巴结转移。本研究结果与Sarafoleanu 等[15]研究结果基本一致。

目前关于Ki-67 增殖抗原表达对恶性肿瘤的作用及其导致肿瘤的机制尚未研究清楚，其是否与其他功能蛋白互相作用共同影响肿瘤的恶性程度需深入研究。但是本研究表明Ki-67 增殖抗原在下咽癌及喉癌组织中明显高水平表达，且在下咽鳞癌组织中Ki-67 增殖抗原表达水平与颈部区域淋巴结转移情况显著相关，可作为下咽癌及喉癌患者淋巴结是否转移的相关指标，Ki-67 阳性高表达患者可能有淋巴结转移的发生，手术及放疗时要注意对颈部淋巴结的处理。Ki-67 表达与恶性程度呈正比，肿瘤组织分化程度与恶性程度理论上也是相关的，本研究与既往研究的结果不一致的原因可能在于研究对象、患者确诊时间、肿瘤生长时间、样本量大小等的不同。

综上所述，本研究发现在下咽癌及喉癌中Ki-67 表达水平与肿瘤TNM 分期中N 分期存在显著相关性，且Ki-67 表达水平越高，肿瘤越易发生区域淋巴结转移，为下咽癌及喉癌患者个体化、精准化治疗及预后提供理论支持。然而，影响下咽癌及喉癌发生发展的相关因素及机制非常复杂，在下咽癌及喉癌中Ki-67 表达水平对临床诊断、治疗及预后的价值，还需进行多中心、大样本量的研究进一步探究。