郑海蓉，蔡良平，付小蓉，曹春梅，陈 翠，黎小兰，刘光兰

（汤臣倍健股份有限公司，广东珠海 519040）

1 概论

咖啡因是一种黄嘌呤生物碱化合物，提炼自茶叶、咖啡果等的成分。对于人的精神有兴奋作用，是一种中枢神经兴奋剂[1]，摄入后可以达到驱除睡意、恢复精力的效果[2-4]。近年来，添加了咖啡因的茶叶、咖啡、能量饮料等饮品在人群中十分受欢迎[5-6]，上班族尤甚，由于具有成瘾性，长期大量服用咖啡因会伤害人的身体，在停用后会出现戒断症状，如精神不振、浑身无力等[7-9]，国家对于咖啡类饮料、能量胶等的咖啡因规定了限量指标[10-11]，而咖啡因也被列入国家管制的精神类药品。

目前，咖啡因的检测方法主要有高效液相色谱法、超高效液相色谱法、紫外分光光度法[12-18]，使用高效液相色谱法，即国标GB/T 5009.197—2003[19]中咖啡因的含量测定方法，根据JJF 1059.1—2012《测量不确定度评定与表示》[20]中提到的不确定度评定[21-22]程序，并参考JJG 196—2006《常用玻璃量器检定规程》[23]中用到的玻璃仪器的不确定度等，对测定样品葡萄籽胶囊中咖啡因含量时涉及到各分量带来的不确定度进行评估，以便参考试验结果的不确定度，在日后开展日常试验时加以注意。

2 材料与方法

2.1 材料与试剂

咖啡因对照品（质量浓度为500 μg/mL，扩展不确定度为1%） （批号：GBW(E)100174），北京海岸鸿蒙标准物质技术有限责任公司提供；葡萄籽胶囊（批号19390），汤臣倍健股份有限公司提供；1- 庚烷磺酸钠（离子对试剂）、甲醇（色谱纯），上海安谱实验科技股份有限公司提供；磷酸（分析纯），广东广试试剂科技有限公司提供；乙腈（色谱纯），上海星可高纯溶剂有限公司提供。

2.2 仪器与设备

Agilent 1260 型高效液相色谱仪（配VWD）；C18反相色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm） （菲罗门），P180H 超声波清洗器，德国Elma 产品。

2.3 试验方法

2.3.1 仪器条件

流动相：混合溶液1- 癸烷磺酸钠溶液（1.22 g-850 mL） +乙腈+磷酸=850+150+1；流速1.0 mL/min；色谱柱：C18，柱长250 mm，内径4.6 mm，粒径5 μm；柱温30 ℃，进样量2 μL。

2.3.2 标准溶液配制

精确量取咖啡因对照品1.00 mL 于25 mL 棕色容量瓶中，溶于甲醇+水+磷酸=100+400+0.5 混合溶液中并定容至刻度，摇匀，质量浓度为0.02 mg/mL。

2.3.3 供试品溶液配制

取20 粒以上片剂或胶囊试样研磨或混匀，称取一定量试样于试管中，加入甲醇+ 水+ 磷酸=100+400+0.5 混合溶液50 mL，超声振荡提取5 min后，离心沉淀杂质，用0.45 μm 的有机相滤膜过滤其上清液，即得样品溶液。

2.3.4 计算公式

所选样品葡萄籽中咖啡因含量的计算如下：

式中：X——样品中咖啡因的含量，mg/g；

C——样品溶液的质量浓度，mg/mL；

V——样品溶液定容体积，mL；

K——单位转换系数，K=1；

m——称取葡萄籽样品的质量，g。

3 结果与分析

3.1 不确定度的来源分析

咖啡因试样含量测定的不确定度来源见图1。

根据整个试验过程及图1 所示的不确定度来源分析，主要有以下几个不确定度来源。

图1 咖啡因试样含量测定的不确定度来源

试样重复测定时，重复性引起的不确定度ur(X1)。

标准品量取及稀释配制溶液引起的标准不确定度ur(X2)。

样品称量及样品溶液配制引起的标准不确定度ur(X3)。

仪器（高效液相色谱仪） 引起的标准不确定度ur(X4)。

标准曲线拟合引起的标准不确定度ur(X5)。

3.2 不确定度传播律

根据不确定度的测量模型计算公式，使用以下公式计算合成相对不确定度：

3.3 不确定度各分量评估

3.3.1 测量重复性引入的不确定度ur(X1)

按照GB/T 5009.197—2003 对所选定值样品的咖啡因含量平行测定12 次，得到表1 中的数据。该测定产生的不确定度属于A 类不确定度，采用A 类评定方式。

葡萄籽胶囊（澳洲进口） 样品中咖啡因的含量重复测定12 次结果见表1。

表1 葡萄籽胶囊（澳洲进口） 样品中咖啡因的含量重复测定12 次结果/mg·g-1

按贝赛尔公式计算出试验标准偏差为：

在日常检验中，该样品中咖啡因含量重复测定2 次时，其测量结果为2 次结果的算术平均值，故由样品重复测定而引起的标准不确定度为：

3.3.2 标准物质引起的标准不确定度分量ur(X2)

3.3.2.1 标准物质含量引入的不确定度ur（X3.3.2.1）

查询咖啡因的标准物质证书，得知该标准溶液的质量浓度为500 μg/mL，扩展不确定度为1%，k=2，则有：

相对标准不确定度：ur（X3.3.2.1）=1%×500 μg/mL/2/500 μg/mL=0.005.

3.3.2.2 标准物质称量引入的不确定度ur（X3.3.2.2）

用1 mL 刻度移液管进行量取，咖啡因标准物质体积v=1.00 mL；1 mL 刻度移液管（A 级） 的最大的允许误差为±0.001 g，按矩形分布，包含因子k为则有：

3.3.2.3 标准溶液稀释和定容过程引起的不确定度ur（X3.3.2.3）

溶液定容过程引起的不确定度主要由25 mL 单标线容量瓶（A 级） 和室温对液体体积的影响引入的不确定度。

3.3.2.3.1 25 mL 单标线容量瓶校准产生的标准不确定度ur（X3.3.2.3.1）

对照配制时玻璃器具校准引入的不确定度见表2。

表2 对照配制时玻璃器具校准引入的不确定度

由表2 可知，试验中所用的25 mL 单标线容量瓶都属于A 级测量结果，最大允许误差为±0.03 mL，按矩形分布，则有：

3.3.2.3.2 溶液温度与校准温度不同产生的标准不确定度ur（X3.3.2.3.2）

假设溶液与校准温度的差异为±5 ℃，容量瓶的体积为25 mL，甲醇体积膨胀系数α 为(1.18×10-3)/℃，水体积膨胀系数α 为(2.1×10-4)/℃，磷酸的体积变化忽略不计，前述溶剂的体积膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀，故仅考虑溶剂膨胀带来的不确定度即可，根据最大允许误差，按矩形分布，取则有：

25 mL 单标线容量瓶（A 级） 产生的合成相对标准不确定度：

综上可得，咖啡因标准物质引起的相对标准不确定度为：

3.3.3 咖啡因样品引起的标准不确定度ur(X3)

3.3.3.1 样品称量引起的不确定度ur（X3.3.3.1）

称取试样重量m=0.1 g，查询所用电子天平的校准证书，最大的允许误差为±0.000 05 g，偏载测试最大的允许误差为±0.001 g，属正态分布，k=2，则有：

合成标准不确定度为：

3.3.3.2 样品定容引起的不确定度ur（X3.3.3.2）

样品溶液稀释定容时带来的不确定度主要由定容时用到的50mL 单标线容量瓶（A 级） 引入。

3.3.3.2.1 50 mL 单标线容量瓶校准产生的标准不确定度ur（X3.3.3.2.1）

样品配制时玻璃器具校准引入的不确定度见表3。

表3 样品配制时玻璃器具校准引入的不确定度

由表3 可知，试验中所用的50 mL 单标线容量瓶都属于A 级测量结果最大允许误差为±0.05 mL，

3.3.3.2.2 溶液温度与校准温度不同产生的标准不确定度ur（X3.3.3.2.2）

假设溶液与校准温度的差异为±5 ℃，容量瓶的体积为50 mL，甲醇体积膨胀系数α 为(1.18×10-3)/℃，水体积膨胀系数α 为(2.1×10-4)/℃，磷酸的体积变化忽略不计，前述溶剂的体积膨胀明显大于容量瓶的体积膨胀，故仅考虑溶剂膨胀带来的不确定度即可，

标准不确定度为：

相对标准不确定度为：

50 mL 单标线容量瓶（A 级） 产生的合成相对标准不确定度：

由上面分析可得，咖啡因样品引起的相对标准不确定度为：

3.3.4 高效液相色谱仪引起的不确定度ur(X4)

高效液相色谱仪引入的不确定度分量评定ur（X3.3.4）。液相色谱仪峰面积积分处理最大误差为±1%，k=2，样品峰面积的平均值A 为236.927 09，则有：

标准不确定度为：

相对标准不确定度为：u（rX3.3.4）=u（rX3.3.4)/A=1%×236.927 09/2/236.927 09=0.005.

高效液相色谱仪引起的不确定度：

3.3.5 标准曲线拟合产生的不确定度分量评定ur（X5）

标准曲线数据见表4。

表4 标准曲线数据

可用以下公式计算质量浓度x测量时由标准曲线带来的变化的不确定：

式中：SR——工作曲线标准差；

b——工作曲线斜率；

p——样品液测量的次数，12；

x——样品测得平均质量浓度，0.041 112 45，mg/mL；

n——标准液测量的次数，5；

xi——第i 次测量时标准液质量浓度，mg/mL；

c——标准液平均质量浓度，0.052 09 mg/mL；

a——工作曲线截距；

Ai——第i 次测量时标准液的峰面积；

由标准曲线拟合引入的相对标准不确定度：

相对标准不确定度一览表见表5。

表5 相对标准不确定度一览表

3.4 合成相对标准不确定度评定

由表4 中各相对标准不确定度合成

各测量不确定度的统计直方图见图2。

图2 各测量不确定度的统计直方图

样品测定的平均值为19.05 mg/g，则样品中咖啡因测定的标准不确定度为：

ucr(X)=X×ur(X)=19.05×0.013 3=0.25 mg/g.

3.5 扩展不确定度

根据上步2.4 所得到的标准不确定度乘以包含因子即可得到样品的扩展不确定度，取置信概率p=95%，k=2，则测量葡萄籽中咖啡因含量时扩展不确定度计算公式如下：此次测定的咖啡因样品平均含量为19.05±0.50 mg/g。

4 结论

从图2 可以看出，样品中咖啡因含量的不确定度因素中，标准曲线拟合跟标准溶液配制带来的不确定度最大，而样品溶液的配制和高效液相色谱仪所带来的不确定度最小，说明在日后检验咖啡因的含量时，应注重液相色谱仪的状态和标准溶液的配制过程，具体体现在勤于维护高效液相色谱仪、定期检查检测器的紫外灯能量、仪器进样时定量是否准确，以及定期校正高效液相色谱仪，进行期间核查；配置标准溶液时，移取标准溶液时选用高校准级别的移液管、高校准级别的容量瓶，并避免温度波动过大对溶液体积带来的影响，人员操作时应将检测流程及注意事项充分掌握，以使检测结果更准确。