乔香君，吴 影，赵丽娜，古绍彬

（1. 郑州航空港经济综合实验区综保区和口岸服务局，河南郑州 450019；2. 河南科技大学 食品与生物工程学院，河南 洛阳 471003；）

解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens） 属于一种对人畜无毒害的G+细菌，产芽孢[1-2]。其芽孢可在胃肠道中生存和发芽[3]，并代谢分泌蛋白酶、淀粉酶和脂肪酶[4]，增强肠内营养物质的消化率和吸收能力[5]。同时，还具有较强的抗逆能力和广谱抗菌活性[2，6]，稳定性好，能调节动物免疫力，可作为抗生素生长促进剂的替代品[7-10]，在动物生产中越来越受到重视。Gu W 等人[11]研究发现，将解淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238 喂食尼罗罗非鱼（Oeochromis niloticus）可以提高生长性能，并提高对产气荚膜梭菌的抗病能力。Lei X 等人[12]证明解淀粉芽孢杆菌可提高肉鸡生产性能，减轻免疫应激，并且改善肠道菌群介导的病原体抗性。Wang Y 等人[13]发现B. amyloliquefaciensSC06 可调节宿主代谢和肠道菌群，保护小鼠免受高脂饮食诱导的肥胖和肝损伤。此外，研究发现淀粉芽孢杆菌BLCC1-0238 可通过提高产蛋鸡的免疫力，和调节其生殖激素来有效提高产蛋性能和蛋品质[14]。

另外，解淀粉芽孢杆菌可以产生多种胞外酶，能够促进大分子营养物质的消化吸收，提高肠道吸收力和营养消化率[15-16]。加拿大卫生部批准解淀粉芽孢杆菌作为淀粉酶、蛋白酶、葡聚糖酶和半纤维素酶等食品酶的来源，被越来越多地应用到食品加工中[15，17]。因此，近些年解淀粉芽孢杆菌也成为应用广泛的益生菌之一[18-20]。目前，国内外学者多采用固体发酵法获得生产中使用的解淀粉芽孢杆菌[21]，但这种方法制备的是菌体与发酵基质的混合物，很难分离得到解淀粉芽孢杆菌，不利于用解淀粉芽孢杆菌的工业化生产食品酶。

为了进一步提高解淀粉芽孢杆菌BA118 菌株液体发酵水平，在单因素试验的基础上，通过响应面设计试验，对BA118 的工业发酵培养基和发酵条件进行了优化，确定了该解淀粉芽孢杆菌BA118 高密度培养的发酵工艺，为其在工业化生产中的应用奠定了基础。

1 材料与方法

1.1 菌种

解淀粉芽孢杆菌BA118，保藏于河南科技大学微生物实验室。

1.2 仪器和试剂

WFZ·UV-2800AH 型紫外- 可见分光光度计，尤尼柯产品；PHS-25 型pH 计，雷磁产品。

玉米淀粉、土豆淀粉、玉米浆、黄豆饼粉，市售；糊精，北京奥博星生物技术有限责任公司提供。

1.3 培养基

（1） 牛肉膏蛋白胨培养基（g/L）。蛋白胨10.0 g，牛肉膏5.0 g，NaCl 5.0 g，pH 值7.0~7.2，固体需加2%的琼脂。

（2） 基础发酵培养基（g/L）。可溶性淀粉10.0 g，大豆蛋白胨5.0 g，NaCl 5.0 g，pH 值7.0。

1.4 试验方法

1.4.1 种子液的制备

将解淀粉芽孢杆菌的保藏菌种接种到牛肉膏蛋白胨固体斜面培养基，于37 ℃下培养24 h，备用。取2 环活化菌种，接入装有50 mL 牛肉膏蛋白胨培养基的250 mL 三角瓶中，37 ℃下以转速180 r/min振荡培养24 h，制成种子液。

1.4.2 解淀粉芽孢杆菌BA118 培养方法

将种子液接种于牛肉膏蛋白胨液体培养基，接种量5%，装液量30/250 mL，于37 ℃下以转速180 r/min 振荡培养24 h。

1.4.3 菌体计数方法

（1） 平板计数。参照文献[22]。

（2） 比浊法。参照文献[23]。

1.4.4 发酵条件优化

通过单因素试验分别考查发酵时间、初始pH值、发酵温度、接种量、转速和装液量对解淀粉芽孢杆菌BA118 发酵菌体密度的影响。

1.4.5 培养基优化单因素试验

（1） 碳源。选择蔗糖、麦芽糖、糊精、玉米淀粉、土豆淀粉为替代碳源。

（2） 氮源。分别以牛肉膏、玉米浆、黄豆饼粉、胰蛋白胨+尿素（质量分数比1∶1）、胰蛋白胨+酵母膏+尿素（2∶2∶1） 替代基础发酵培养基中的大豆蛋白胨制成培养基。

（3） 无机盐。分别以MgSO4、CaCO3、MnSO4、KH2PO4+K2HPO4（1∶1） 为替代无机盐。

1.4.6 响应面试验优化发酵培养基

在单因素试验结果的基础上，选取糊精、玉米浆、MgSO4和KH2PO4+K2HPO4为自变量，运用Design Expert 8.0.5 设计四因素三水平响应面试验。以菌体密度为响应值，采用数据处理软件进行响应曲面分析，对解淀粉芽孢杆菌发酵培养基进行优化。对响应曲面分析得到的最佳培养条件进行3 次平行发酵试验，取平均值，验证模型结果是否可靠，得出最终优化结果。

1.4.7 数据统计与分析

试验数据采用Excel 作图，用SPSS 22.1 软件进行差异显著性分析。所有数值在p＜0.05 时均被认为是显著的，并以平均值±s.e 表示。

2 结果与分析

2.1 BA118 生长特性研究

每2 h 取发酵样品测定OD600nm 光密度值，以发酵时间为横坐标，以光密度值为纵坐标，绘制解淀粉芽孢杆菌BA118 的标准生长曲线。

BA118 发酵条件的优化见图1。

由图1（a） 可知，BA118 在0~4 h 处于生长延滞期；4~26 h 为该菌的对数生长期；26~32 h 时达到平台期；在32 h 后，菌体进入衰亡期，活菌数呈下降趋势。因此，选择BA118 的最佳发酵时间为28 h。

图1 BA118 发酵条件的优化

2.2 发酵条件的优化

2.2.1 pH 值对BA118 生长的影响

微生物都有其最适生长pH 值，B. amyloliquefaciens的最适生长pH 值在7.5 上下，菌株之间的最适pH 值存在一定差异[24]。将种子液分别接种于pH 值6.0，6.5，7.0，7.5，8.0 的液体培养基中，培养28 h后平板计数得出不同pH 值对菌体发酵水平影响的折线图。

由图1（b） 可知，初始pH 值为6.0~8.0 时，发酵菌体数量达到2.34×108~2.48×108CFU/mL，在pH 值7.5 时，BA118 菌体数量达到最大值，可见初始pH 值对菌体数量影响不大。车晓曦等人[25]研究了解淀粉芽孢杆菌SAB-1 发酵条件的优化，发现初始pH 值在5.0~8.0 的条件下，发酵产量差别不大，与试验结果一致。但SAB-1 在pH 值6.0 时菌体数量达到最高峰，在pH 值7.0 时产量最低，与试验中BA118 的最适pH 值7.5 不同，反映出不同的解淀粉芽孢杆菌菌株的最适生长pH 值有差异的特点。

2.2.2 培养温度对BA118 生长的影响

将种子液接种于最适pH 值的牛肉膏蛋白胨培养基中，在培养温度分别为25，30，35，40，45 ℃下培养48 h，然后平板计数。由图1（c） 可知，发酵温度为20~30 ℃时，菌体的生长代谢随着温度的升高而加快；30 ℃为BA118 最适生长温度，菌体数量达到2.7×108CFU/mL。

2.2.3 溶氧量对BA118 生长的影响

发酵液的溶氧浓度直接影响微生物的酶的活性、代谢途径及产物产量[26-27]。发酵液的溶氧量的主要受装液量和转速影响。在其他发酵条件相同的前提下，分别以150，170，190，210，230 r/min 的转速对解淀粉芽孢杆BA118 进行发酵，获得不同转速对BA118发酵水平影响的折线。由图1（d） 可知，随着转速的不断增加，菌体数量呈上升趋势，并在230 r/min时取得最大值。解淀粉芽孢杆菌BA118 为好氧菌，故转速越高，通气量越大，菌株生长越旺盛。将种子液分别接种到装液量为20/250，30/250，40/250，50/250 mL 的最适pH 值的牛肉膏蛋白胨培养基中，最适条件下培养，平板计数。由图1（e） 可知，菌体数量随装液量的增加呈现先增加后减少趋势，并在40/250 mL 时取得最大值。当装液量少于40/250 mL时，发酵液中的碳氮源等营养成分较少，菌体生长受到限制；当装液量大于40/250 mL 时，溶氧含量降低，影响微生物的有氧呼吸，导致活菌数量下降。因此，选择BA118 的装液量为40/250 mL，发酵转速为230 r/min。

2.2.4 接种量对BA118 生长的影响

接种量对菌体生长影响较大，合适的接种量能提高微生物对培养基的利用率，加速菌株的生长[28]；分别以1%，2%，3%，4%，5%的接种量进行发酵，平板计数。由图1（f） 可知，BA118 的最适接种量为2%，过大的接种量会大大消耗发酵液中的营养成分，并代谢产生过多的次级代谢产物而影响菌体的生长[29]。

通过单因素试验确定，在pH 值7.5，温度30 ℃，转速230 r/min，接种量2%，装液量40/250 mL 条件下进行发酵时，菌体数量达到最高，为3.73×108CFU/mL。

2.3 BA118 液体发酵培养基的优化

2.3.1 碳源、氮源和无机盐对菌体数量的影响

BA118 发酵培养基优化见图2。

由图2 可知，当碳源为5 g/L 糊精时，菌体数量明显高于其他碳源。氮源为牛肉膏和玉米浆时，对BA118 的发酵水平影响较大。玉米浆营养丰富，含有多种氨基酸、可溶性蛋白、生物素、维生素、金属离子和糖等，能够替代酵母粉、牛肉膏，降低生产成本[30]。因此，确定10 g/L 玉米浆为BA118 生长所需最佳氮源。在无机盐试验中发现，添加3 g/L MgSO4和7 g/L KH2PO4+K2HPO4两类无机盐时，均获得了较高生物量，确定MgSO4和KH2PO4+K2HPO4同时为BA118 生长所需无机盐。通过单因素试验筛选出BA118 的最适培养基为糊精5 g/L，玉米浆10 g/L，MgSO43 g/L和KH2PO4+K2HPO47 g/L。

图2 BA118 发酵培养基优化

但上述单因素试验无法分析各营养因素之间的交互作用，响应面法通过回归方程拟合建立各因素与响应值之间的函数关系，分析优化各因素的工艺参数，并可预测响应值[31]，是一种能高效降低试验次数且准确的分析模型。

2.3.2 Box- behnken 响应面试验

（1） 响应面分析试验设计与结果。由单因素试验选取糊精、玉米浆、MgSO4和KH2PO4+K2HPO44 个因素为自变量，设计四因素三水平的响应面分析。

响应面分析因素与水平设计见表1，Box-behnken试验设计及结果见表2。

表1 响应面分析因素与水平设计/g·L-1

表2 Box-behnken 试验设计及结果

应用Design Expert 8.0.5 软件对上述表2 中各试验点的响应值进行回归分析，用于研究显著因素糊精添加量（A），玉米浆添加量（B），MgSO4添加量（C） 和KH2PO4+ K2HPO4添加量（D） 之间的相互作用，并确定其最佳水平。得到菌体数量（Y） 对自变量的二次多项回归模型方程：

回归方程的方差分析见表3。

由表3 可知，该二次模型多元相关性系数R2=0.929 5，表明仅有7.05%的变异不能由此模型解释；因变量菌体数量与本研究所考查自变量之间的回归模型极显著（p＜0.01），表明数据与模型拟合良好、模型成立，拟合程度较高；失拟项p值为0.098 3，表明失拟项不显著，说明试验所得的二次方程能较好的对响应值进行预测，即能较好地预测菌体数量随MgSO4、玉米浆、糊精、KH2PO4+K2HPO4的变化规律。从回归方程可知，B，A2，B2，C2，D2极显著（p＜0.01），A，C，AD，BC，BD显著（p＜0.05），其他影响均不显著（p＞0.05）。各自变量对菌体数量影响的主次因素依次为玉米浆＞硫酸镁＞糊精＞KH2PO4+K2HPO4。

表3 回归方程的方差分析

（2） 响应面交互作用分析。根据上述拟合回归方程，通过软件分析得到交互因子的响应面图和等高线图。发现3 个响应表面图都具有一个带有向下开口的凸表面。每个响应曲面代表着，2 个因素保持在编码水平的0 水平，另外2 个独立因素之间的交互作用。通过响应面图曲面的坡度变化和等高线图的形状，可以判断出优化因子之间交互作用的强弱。若响应面图曲面坡度比较陡峭，说明该因素对响应值比较敏感；相反，若响应面图曲面比较平缓，说明该因素对响应值不敏感。从等高线图的形状分析，如果为圆形，说明因素间交互作用弱；如果为椭圆形，代表因素间交互作用较强[32-33]。

AD交互作用对BA118 菌体数量的影响见图3，BC交互作用对BA118 菌体数量的影响见图4，BD交互作用对BA118 菌体数量的影响见图5。

图4 BC 交互作用对BA118 菌体密度的影响

由图3 ~图5 可知，发酵液BA118 菌体数量随着糊精、玉米浆、硫酸镁和KH2PO4+K2HPO4添加量的变化，均呈现先增大后减小的趋势，曲面的顶点即为菌体数量最大值点。其中，糊精和KH2PO4+K2HPO4的交互作用，玉米浆和硫酸镁的交互作用，以及玉米浆和KH2PO4+K2HPO4的交互作用的响应面曲面的坡度陡峭，等高线图呈椭圆形，表明两因子交互作用较强。

图3 AD 交互作用对BA118 菌体数量的影响

图5 BD 交互作用对BA118 菌体数量的影响

（3） 响应面优化结果验证。结合响应值与各因素关系的二阶经验模型及三维响应面图，确定发酵液的最优配方各组分质量浓度为玉米浆11.36 g/L，糊精5.50 g/L，MgSO43.38 g/L，KH2PO4+K2HPO45.96 g/L。在优化配方条件下，获得的解淀粉芽孢杆菌BA118菌体数量的理论预测值为6.345 51×109CFU/mL。结合试验实际操作，将培养基各组分质量浓度调整为糊精5.50 g/L，玉米浆11.50 g/L，MgSO43.50 g/L，KH2PO4+K2HPO4（1∶1） 6.00 g/L。为验证预测结果，在该配方下进行摇瓶发酵试验（重复3 次），结果发酵获得的菌体数量分别为6.33×109，6.61×109，6.98×109CFU/mL，均值为6.64×109CFU/mL，与响应面理论预测值6.345 51×109CFU/mL 基本吻合，证实了响应面模型的有效性。

3 结论

通过单因素试验与响应面设计分析，确定了解淀粉芽孢杆菌BA118 的最佳发酵条件为培养时间28 h，初始pH 值7.5，培养温度30 ℃，转速230 r/min，接种量2%，装液量40/250 mL。发酵培养基最佳配方各组分质量浓度为糊精5.50 g/L，玉米浆11.50 g/L，硫酸镁3.50 g/L，磷酸氢二钾+磷酸二氢钾6.00 g/L。通过发酵条件和发酵培养基的工艺优化，最终将菌体产量提高了28.3 倍，菌体数量达到6.64×109CFU/mL，为解淀粉芽孢杆菌的工业化生产奠定了基础。