◎ 李家怡，林 巧，刁尚鹏，吴 兵，刘军华，杨雨欣，任妍菱，陈 瑶，陈亦然，邓友胜，祝艺嘉

（1.攀西特色作物研究与利用四川省重点实验室，四川 西昌 615013；2.德昌县茂源长（童耳朵）食品有限责任公司，四川 德昌 615599）

建昌板鸭由德昌特色建昌鸭经传统腌制风干工艺处理一个月左右而成。目前尚无科学的盐水鸭长期贮存方法，易繁殖微生物，导致鸭肉失鲜、失色、失去光泽、发黄甚至腐败变质[1]。细菌在板鸭产品的贮藏过程中起着关键的作用，其决定了建昌板鸭的货架期长短。以往对建昌板鸭微生物区系的研究大多基于微生物的纯化和鉴定，工作量较大，易遗漏一些不能培养的微生物，不能反映建昌板鸭不同时期的细菌组成情况。高通量测序技术有助于更全面、真实地掌握食品保藏过程中微生物的种群结构和变化、更全面地了解建昌板鸭贮藏过程中的菌群变化规律。本实验以板鸭保藏过程中不同时间段的细菌群落构成为研究对象，采用llumina MiSeq高通量测序技术对11个样品中的细菌菌群结构及多样性变化规律进行研究，并对建昌板鸭货架期和优势腐败菌进行了研究[1]。

1 材料与方法

1.1 样品采集

采用《肉与肉制品 取样方法》（GB/T 9695.19—2008），对建昌板鸭储存的第1 d、11 d、13 d、17 d、21 d、25 d、33 d、37 d、41 d、49 d和62 d进行无菌取样，每次取样25～30 g，取样后置于-80 ℃冰箱冷藏。

1.2 仪器与设备

高通量测序仪（百迈客生物科技有限公司）；超净工作台（无锡一净净化设备有限公司）；HiSeq测序平台（Illumina公司）。

1.3 高通量测序

委托百迈客生物科技有限公司进行测序。

1.3.1 基因序列扩增及测序

对样品进行DNA提取后，用PCR仪进行扩增，扩增区域为细菌的16SrRNA基因V3～V4区。扩增完成后，使用2%琼脂糖凝胶电泳进行检测，将DNA纯化后建库。最后，利用HiSeq台进行测序，对测序结果进行处理，对样品进行多样性分析、组成分析和样品差异分析。

1.3.2 序列分析

测序得到的原始数据（Raw Data）中有一定的干扰数据（Dirty Data），将原始数据进行拼接、过滤、去嵌合体后，得到有效数据（Effective Tags），在97%相似度阈值下，用RDP软件将序列在SILVA和UNITE分类学数据库中进行对比，再进行物种分类，最后参考各序列之间的距离，对多条序列进行OTU聚类。对OTU的数量、Beta-deversity、Alphadeversity以及菌种在每个分类水平上的具体分布情况进行分析，得到相关的微生物群落结构及组成变化。利用MTHUR软件对这些微生物群落的多样性指数和丰度指数进行分析。

1.3.3 数据处理

在Usearch软件上进行操作分类单元（Operational Taxonomic Unit，OTU）聚类分析。一个物种有一个OTU，因此OTU分析可确定物种数量。根据OTU聚类结果和各分类层次的物种比较数据，利用QIME软件，根据分类信息确定OTU多样性的相对指数和序列深度是否足够，分析各分类层次微生物群落的组成及样品的组成和多样性。

2 结果与分析

2.1 16S rDNA V3区测序分析

处理获得的序列信息，去除低质量片段、检测出错误的序列、连接后引物序列以及无法与数据库中序列信息比对一致的序列，获得的序列为有效信息，见表1。有效序列所占比例符合预期[2]。

表1 预处理过程统计表

2.2 测序数据的合理性分析

稀释性曲线（Rarefaction Curve）从样本中随机抽取若干序列，统计这些序列所代表的物种数目，并用序列数与物种数构建曲线，用于验证测序数据量是否足以反映样品中的物种多样性，并间接反映样本中的物种丰富度[3]。图1反映了在连续取样情况下新特征（新物种）出现的速率，在一定范围内，随着测序条数的加大，若曲线表现为急剧上升则表示群落中有大量物种被发现；当曲线趋于平缓，则表示此环境中的物种不会随测序数量的增加而显著增多。稀释曲线可作为对各样本测序量是否充分的判断，曲线急剧上升表明测序量不足，需增加序列条数；反之，则表明样品序列充分，可进行数据分析。

为验证测序量是否能真实反映原始样品的微生物群落的多样性，对建昌板鸭第1 d、11 d、13 d、17 d、21 d、25 d、33 d、37 d、41 d、49 d和62 d的微生物组成多样性利用稀释曲线进行评估。图1显示16S测序的结果中，每个样品的稀释曲线在测序量为10 000 bp左右时基本不再变化，表示本次测序的深度已足够，说明取样合理，测序深度已基本覆盖样品中所有微生物，同时也表明了11个样本微生物组成具有丰富的多样性。

图1 16S测序的样品稀释曲线图

2.3 Venn图分析

2.3.1 OTU数图

将超过97%相似的序列划分为一个OTU，每个OTU对应一个物种。每个样本的OTU数量通过对样本进行聚类得到，如图2所示，样品中细菌数量在贮藏期间呈先减少后增加的趋势，同时也能看到样品中细菌数量在贮藏初始期最高。

图2 16S测序的OTU数图

2.3.2 酒醅菌群的花瓣图

Venn图也可以用花瓣图表示，对11个样本的所有OTU数据进行统计分析，观察每个样本共有的OTU和每个样本独有的OTU（即OTU只存在于一个样本中）。如图3所示，在16S测序的OTU花瓣图中，11个样品中有41条共同的OTU数，仅有发酵后期第41 d、49 d、62 d的样品存在独有的OTU数，说明各样品间大部分是相似微生物，即板鸭产品的整个保藏过程中，独特的细菌种类并不多，但在贮藏期结束时有独特的细菌参与，出现优势腐败菌，其中样品9、10、11具有特有的OTU数分别为1个、1个、4个，即在板鸭贮藏的末期存在独特的细菌参与，随着细菌种类的增多，板鸭的腐败逐渐加速。

图3 16S测序的OTU花瓣图

2.4 物种注释及分类学分析

2.4.1 OTU聚类结果

先将低丰度的OTU处理后，根据最后得到的OTU计算出每个样品中各等级能得到的tags数，再计算出在各分类水平下，物种类型在每个样品中的数目。如表2所示，微生物种类随时间的推移，基本呈现先减少后增加的趋势。

表2 16S测序的各等级中的物种数表

2.4.2 菌群多水平上的物种分布图

（1）门水平。图4中，色块的大小说明其物种的相对丰度比例。为得到最好的视图，仅展示前10个物种的丰富度，后10个物种的总体显示为Others。11个样品在门水平上，含细菌微生物最多是厚壁菌门（Firmicutes），其次为变形菌门（Proteobacteria），且随着时间的变化微生物种类逐渐增多，但在取样的第62 d的样品中，放线菌门（Actinobacteria）所占的比例远高于其他样品，说明放线菌门是板鸭保藏后期的优势菌，可能为腐败菌。

图4 细菌在门水平上的分布图

（2）纲水平。由图5可知，11个样品在纲水平上，含细菌微生物最多的是芽孢杆菌纲（Bacilli），但在取样的第62 d的样品中，放线菌纲（Actinobacteria）所占的比例突增，说明放线菌纲是板鸭保藏后期的优势菌，可能为腐败菌。

图5 细菌在纲水平上的分布图

（3）目水平。由图6可知，11个样品在目水平上，含细菌微生物优势菌为乳杆菌目（Lactobacillales）和芽孢杆菌目（Bacillales），但在取样的第62 d的样品中，棒状杆菌目（Corynebacteriales）所占的比例突增，说明放线菌纲中的棒状杆菌目是板鸭腐败期的优势菌。

图6 细菌在目水平上的分布图

（4）科水平。由图7可知，11个样品在科水平上，含细菌微生物优势菌为葡萄球菌科（Staphylococcaceae）和肠球菌科（Enterococcaceae），第62 d的样品中，棒状杆菌科（Corynebacteriaceae）所占的比例突增，说明放线菌纲中的棒状杆菌目棒状杆菌科是板鸭腐败期的优势菌。

图7 细菌在科水平上的分布图

（5）属水平。由图8可知，贮藏末期乳杆菌属（Lactobacillus）逐渐增多，第62 d的样品中，棒状杆菌属（Corynebacterium）所占的比例突增，说明乳杆菌属、棒状杆菌属是板鸭腐败期的优势菌。

图8 细菌在属水平上的分布图

（6）菌群丰度聚类热图。热图是数据矩阵中值的一种图形表示形式，根据种类或样本丰度相似性进行聚类。将高丰度和低丰度的物种分块聚集，并通过颜色梯度和相似度反映群落组成的相似性和差异性。根据每个样本的种类组成和相对丰度，在门水平上提取物种，用R语言工具绘制，在门水平上进行热图的数据聚类分析[4]。

热图聚类结果中，纵向聚类表示不同物种在各样品间丰度的相似情况，两物种间距离越近，枝长越短，说明这两个物种在各样品间的丰度越相似；横向聚类表示不同样品的各物种丰度的相似情况，与纵向聚类一样，两样品间距离越近，枝长越短，说明这两个样品的各物种丰度越相似。样品门水平下的物种丰度聚类热图见图9，在门水平上，16S测序中第17 d、62 d的样品物种丰度最相似。

图9 16S测序的丰度聚类热图

2.5 Alpha多样性分析

建昌板鸭在储藏过程中的Alpha多样性指数变化见表3，chao1指数能正确反应OTU数的大小，且值越大，样品的多样性越大。第41 d、49 d、62 d的样品Shannon指数及Simpson指数逐渐增加，并在最后达到最高值，说明储存末期的板鸭细菌群落丰富度逐渐增大和均衡化程度逐渐降低。11份样品的测序覆盖指数均在0.99以上，说明测序数量已达饱和，结果可以反映微生物群落的多样性。

2.6 Beta多样性分析

对板鸭不同贮藏阶段的主成分进行主成分分析（PCA），相关矩阵特征值如表3所示，共提取3个特征值不小于1的主成分，其贡献率分别为74.74%、14.95%、3.43%，主成分分析一般提取包含90%以上信息的主成分，根据主成分特征值及旋转成分矩阵，计算得到板鸭主成分得分，以PC1为横坐标、PC2和PC3为纵坐标，将样本投影到三维坐标系上，得到不同贮藏阶段样品分布情况[5]。由图10可知，在16S测序中，BY1和BY8、BY3和BY6、BY7和BY5最相似。

表3 16S测序中α多样性的相关指数表

图10 建昌板鸭各样品关键风味物质主成分得分图

3 结论与讨论

本实验通过高通量测序平台对建昌板鸭贮藏过程中的微生物进行16S rRNA基因分析，探究其多样性以及群落结构。通过多样性分析发现，随着测序量的增加，各多样性曲线逐渐趋于平行，体现测序达到饱和，测序结果基本能反映不同时期板鸭微生物菌群多样性组成，说明建昌板鸭贮藏过程中其微生物组成具有丰富的多样性。通过群落结构分析发现，其细菌主要分布于厚壁菌门、变形菌门、放线菌门和拟杆菌门等11个门，15个纲，92个属，厚壁菌门为优势菌门。放线菌门随着贮存时间的延长也逐渐增多，厚壁杆菌门中芽孢杆菌纲中的乳杆菌属、放线菌门中棒状杆菌目棒状杆菌属占一定优势。相比其他研究方法，本方法对贮藏过程中的建昌板鸭细菌群落分析更全面，信息量更大，并且利用高通量测序技术能快速了解贮藏过程中的主要腐败菌为乳杆菌属及棒状杆菌属，其中乳杆菌属为主要优势菌，对于建昌板鸭的贮藏和保鲜和研究优势腐败菌的生长变化，深入了解肉品表面微生物群落特征从而延长板鸭的货架期具有十分重要的意义。