陈 稚，刘 昆，刘 薇，袁康瑞，叶晓梅，吴都督，卢洪梅，2*（.广东医科大学，广东东莞 523808；2.广东医科大学附属东莞第一医院，广东东莞 523000）

糖尿病肾病（diabetic nephropathy，DN）是由糖尿病引起的慢性肾脏疾病，临床上主要以肾小管间质纤维化为病理特征。目前临床上常用的治疗方式有饮食替代疗法、血糖血压控制疗法以及药物疗法等。近年来，中药复方因具有多成分、多靶点、多功效、整体调节糖代谢、改善肾功能的作用成为研究的热点。生脉散最早起源于金朝的《医学启源》，配方组成为人参、麦门冬、五味子三味中药，具有益气生津，敛阴止汗的功效，临床上主要用于治疗冠心病、呼吸系统疾病、慢性心力衰竭、缺血性中风等疾病，有研究发现它还可用于气阴两虚型糖尿病及其并发症的治疗，并对肾脏有较好的保护功效[1]，但目前关于生脉散治疗糖尿病肾病的作用机制并未明了。因此，本研究将通过经腹腔注射链脲佐菌素（STZ）构建胰岛素肾病的大鼠动物模型，观察不同剂量的生脉散治疗模型动物后肾组织的病理变化，并分析其对模型动物糖脂代谢、24 h 尿蛋白、肾功能以及蛋白激酶B（Akt）、糖原合成酶激酶-3β（GSK-3β）蛋白的影响，以探讨生脉散改善糖尿病肾病的影响以及作用机制。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 主要仪器 7600 型全自动生化分析仪（Beckman 公司，美国），BX60 型光学显微镜（日本 OLYMP US 公司），AUW120D 电子分析天平（Shimadzu 公司，日本），DYCP-24DN 电泳仪（北京六一仪器厂，中国），WB 红外显影仪（Gene Company Linited 公司，美国），ABI 9700 逆转录PCR 仪（ABI 公司，美国），PikoReal荧光定量PCR 仪（Thermo Scientific 公司，美国），便携式血糖仪（江西奥斐特商贸有限公司）。

1.1.2 药物与试剂 受试药物如《方剂学》第七版所载：人参、麦冬、五味子，按3∶3∶2 比例组成，即人参9.0 g、麦门冬9.0 g、五味子6.0 g，麦冬和五味子用10倍量水煎煮1.5 h 后，人参用10 倍水另煎1.5 h，三者相互混合，滤出药液，浓缩至0.5 g/mL。生脉散用药剂量依据2015 年版《中华人民共和国药典》，参考《药理试验方法学》中人和动物体表面积比值计量表折算的等效剂量，得出用药总量为200.00 mg/kg，将该剂量设为中剂量；将400.00、50.00 mg/kg 分别设为高剂量和低剂量。氯沙坦钾（北京百灵威科技有限公司，国药准字：H20200780），尿蛋白含量检测试剂盒（碧云天生物技术研究所，批号：P0506），STZ（上海金穗生物科技有限公司，批号：40584628），TRIzol 试剂（武汉三鹰生物技术有限公司，批号：22006-1-AP），实时定量PCR 试剂盒（北京生物有限公司，批号：654744），GSK-3β、AKT 蛋白（北京冬歌博业生物科技有限公司，批号：405267 及364142）。

1.1.3 实验动物和分组 SD 大鼠60 只，雄性，SPF级，身体质量（100±10）克，由广东医科大学动物实验中心提供，许可证号码SCXK（粤）2021-0008。大鼠饲养于广东医科大学动物实验中心动物房，饲养环境室内温度（25±2）℃，湿度50%～70%，12 h 昼夜间断照明，动物自由饮水进食，期间定时定量添加饲料及更换垫料。进行适应性喂养1 周后，大鼠随机被分为对照组（10 只）和造模组（50 只），造模组用高糖高脂饲料持续喂养8 周并结合腹腔注射30 mg/kg STZ 诱导大鼠建立糖尿病肾病模型[17]；对照组大鼠喂养普通饲料。

1.2 方法

造模成功的糖尿病大鼠随机被分为模型组、氯沙坦钾组（16.00 mg/kg）、生脉散低剂量组（50.00 mg/kg）、生脉散中剂量组（200.00 mg/kg）和生脉散高剂量组（400.00 mg/kg），每组10 只。生脉散低、中、高剂量组每日定时以相应剂量生脉散药液灌胃，模型组和对照组给予等量0.9% NaCl 溶液灌胃，连续6 周，期间配合普通饲料喂养。

1.3 检测指标

1.3.1 大鼠糖脂代谢的测定 所有动物在取标本前均禁食并自由饮水，禁食12 h 后，采用剪尾法从尾静脉末梢取血0.2 mL 收集于干燥试管中，3 000 r/min 离心15 min 后，取血清用于检测。采用血糖仪检测各组大鼠空腹血糖浓度，用全自动生化分析仪检测甘油三酯、胆固醇、低密度脂蛋白浓度。

1.3.2 24 h 尿蛋白、肾功能相关指标的测定 所有动物在取标本前均禁食并自由饮水，禁24 h 后，收集24 h尿液，采用放射免疫法测定24 h 尿微量蛋白含量，操作严格按照说明书进行。取各组大鼠血清，全自动生化分析仪检测肾功能相关指标血肌酐和尿素氮的含量。

1.3.3 HE 染色观察肾脏组织病理变化 处死大鼠后取出大鼠肾脏组织，经生理盐水漂洗后用福尔马林溶液固定，切片，进行HE 染色，显微光镜下观察大鼠肾脏结构变化

1.3.4 Western Blot 法测定肾组织Akt、GSK-3β 蛋白的表达 取各组大鼠肾脏组织约50 mg 匀浆，加入细胞裂解液RIPA 提取总蛋白，采用BCA 法测定蛋白水平。将提取的蛋白样品经过10%SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳进行蛋白分离，将分离后的蛋白电转移至PVDF 膜，用5%脱脂牛奶封闭，然后分别加入GSK-3β抗体稀释液（1∶1 000）和β-actin 抗体稀释液（1∶300），4 ℃下孵育过夜。最后加入二抗，室温孵育2 h，电化学发光显影检测。采用Image J 软件对蛋白条带灰度值进行分析。

1.4 统计学处理

采用SPSS 18.0 软件进行统计学处理。计量资料以表示，采用单因素方差分析及LSD-t检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 生脉散对大鼠糖脂代谢的影响

与对照组比较，模型组大鼠的空腹血糖升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；甘油三酯（胆固醇或低密度脂蛋白）水平差异无统计学意义（P＞0.05）。与模型组比较，氯沙坦钾组和生脉散低、中、高剂量组大鼠的空腹血糖水平升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；甘油三酯（胆固醇或低密度脂蛋白）水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表1。

表1 生脉散对大鼠糖脂代谢的影响 （，n=10，mmol·L-1）

表1 生脉散对大鼠糖脂代谢的影响 （，n=10，mmol·L-1）

与对照组比较：aP＜0.05；与模型组比较：bP＜0.05

2.2 生脉散对糖尿病肾病大鼠24 h 尿蛋白及肾功能的影响

与对照组比较，模型组大鼠的24 h 尿微量白蛋白、尿素氮和肌酐水平升高，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，氯沙坦钾组和生脉散中、高剂量组大鼠的24 h 尿微量白蛋白、尿素氮和肌酐水平均降低，差异均有统计学意义（P＜0.05）；与模型组比较，生脉散低剂量组24 h 尿微量白蛋白、尿素氮水平均降低（P＜0.05），肌酐水平差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2。

表2 生脉散对糖尿病肾病大鼠24 h 尿蛋白及肾功能的影响 （，n=10）

表2 生脉散对糖尿病肾病大鼠24 h 尿蛋白及肾功能的影响 （，n=10）

与对照组比较：aP＜0.01；与模型组比较：bP＜0.01，cP＜0.05

2.3 生脉散对大鼠肾组织病理变化的影响

对照组大鼠肾组织细胞形态结构完整清晰，未发生明显病理变化。模型组大鼠肾小球基底膜增厚，体积变大，肾小管基膜增厚或分裂，结节性肾小球硬化。生脉散高剂量组大鼠肾脏组织坏死细胞较对照组明显减少，肾小管结构基本完整。见图1。

图1 各组大鼠肾脏组织病理变化

2.4 生脉散对糖尿病肾病大鼠Akt、GSK-3β 蛋白表达的影响

与对照组比较，模型组大鼠Akt 蛋白表达水平降低，GSK-3β 蛋白表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，生脉散低、高剂量组大鼠Akt 蛋白表达水平升高，差异有统计学意义（P＜0.01），生脉散低剂量组GSK-3β 蛋白表达水平差异无统计学意义（P＞0.05），生脉散高剂量组GSK-3β 蛋白表达水平降低（P＜0.01）。见图2、表3。

表3 生脉散对糖尿病肾病大鼠Akt、GSK-3β 蛋白表达的影响（，n=10）

表3 生脉散对糖尿病肾病大鼠Akt、GSK-3β 蛋白表达的影响（，n=10）

与正常组比较：aP＜0.01；与模型组比较：bP＜0.01

图2 生脉散对对糖尿病肾病大鼠Akt、GSK-3β 蛋白的表达

3 讨论

糖尿病肾病属于糖尿病引发的严重并发症之一，一旦形成便难以治愈，是一种危害极大的慢性疾病，也是导致终末期肾脏病的重要原因[2]。有文献报道生脉散对糖尿病及其并发症具有较好的治疗效果，其中麦冬多糖能显著降低糖尿病肾病大鼠肾脏指数和BUN水平，降低肾脏p47phox、NF-κB 的表达[3]；人参皂苷通过调节血清氧化应激指标，下调炎性因子和以及肾组织相关蛋白的表达来改善DN 大鼠肾功能[4]；五味子提取物可提高糖尿病大鼠的肾脏MMP-2 活性、抑制TIMP-2 的表达来改善肾小球细胞外基质降解[5]。

本研究通过采用腹腔注射STZ（40 mg/kg）的方法建立糖尿病肾病大鼠模型，并观察生脉散对大鼠糖脂代谢、24 h 尿蛋白、肾功能、肾组织病理变化的影响。实验结果发现，生脉散干预后，不同剂量组糖尿病肾病大鼠的血糖、24 h 尿微量白蛋白、尿素氮和肌酐水平均低于模型组（P＜0.01 或0.05），且生脉散高剂量组大鼠肾脏组织病变减轻，坏死细胞较模型组更少且肾小管肾小球结构基本完整，说明生脉散可显著改善糖尿病肾病大鼠的肾组织，减少糖尿病对肾组织损伤，对DN 大鼠的肾功能起到保护作用。

Akt/GSK-3β 信号通路具有调节血糖的作用，与大鼠肾功能密切相关，是重要的胰岛素信号通路。Akt蛋白能调控细胞的增殖与凋亡，共有Akt1、Akt2 和Akt3 三种有着相同结构的蛋白异形体。有研究表明Akt1 和Akt2 在TGF-β1 介导的大鼠肾小管上皮细胞转分化过程中过度表达，从而促进糖尿病并发症的发生[6]。并且Ying 等[7]发现，通过激活Akt 信号通路抑制氧化应激，可以改善膜细胞凋亡，减缓糖尿病造成的肾损伤。此外，陶海英等[8]发现，随着大鼠肾脏组织Akt 蛋白水平的升高，大鼠24 h 蛋白尿和肾脏指数均显著降低，肌酐清除率显著升高，其机制可能是通过调节Akt 蛋白表达，从而减缓糖尿病肾病模型大鼠的肾损伤。

抑制GSK-3β 活性，可降低DN 大鼠蛋白尿水平，改善肾脏凝血纤溶状态，对肾脏起到保护作用。王雪梅等[9-10]发现GSK-3β 可通过磷酸化多种内源性底物，包括参与代谢的多种蛋白和转录因子等，在血糖稳态调控、细胞生长、发育等过程中发挥重要作用。由此可见，探索Akt/GSK-3β 信号通路是研究生脉散对DN 大鼠的保护作用的重要途径。

本研究western blot 的结果表明，生脉散可抑制糖尿病大鼠GSK-3β 蛋白的表达，上调Akt 蛋白的表达，与模型组比较，生脉散各剂量组大鼠肾脏GSK-3β 蛋白表达显著降低，Akt 蛋白表达水平显著上升（P＜0.01），且生脉散高剂量组较低剂量组对Akt、GSK-3β 蛋白的表达影响更明显，这提示Akt/GSK-3β信号通路对DN 大鼠的肾功能起着至关重要的作用。生脉散减缓糖尿病致肾损伤的机制可能是通过调控Akt、GSK-3β 蛋白表达，从而减缓氧化应激造成的大鼠肾损伤，达到治疗大鼠糖尿病肾病的目的。