慢性冷暴露对小鼠产热及肝脏结构和脂质代谢相关蛋白表达的影响

2022-07-11周万慧胡亚婕李晓双杨玉英李士泽

动物营养学报 2022年6期

周万慧胡亚婕张萌李晓双徐彬杨玉英李鹏李士泽

(黑龙江八一农垦大学动物科技学院,动物医学基础国家级实验教学示范中心,黑龙江省牛病防治重点实验室，大庆 163319)

冷应激是常见的环境应激源之一。低温条件下动物机体脂肪分解加快，自身产热以维持核心温度[1-4]。肝脏作为营养物质代谢、免疫、内分泌等生理过程的关键枢纽，其脂质代谢紊乱将会造成代谢性相关疾病，如非酒精性脂肪肝、糖尿病等。因此，探究慢性冷暴露下小鼠产热及肝脏脂质代谢水平的变化，为慢性冷暴露对机体损伤的防治提供参考和理论依据十分重要。肝脏脂质代谢的调控方式包括摄取血浆中的脂肪酸、脂质从头合成(denovolipogenesis，DNL)、脂质的β氧化以及极低密度脂蛋白的运输[5-6]。固醇调节元件结合蛋白1(sterol regulatory element binding protein 1, SREBP1)通过诱导脂肪酸合成酶(fatty acid synthase,FASN)和乙酰辅酶A羧化酶1(acetyl coenzyme A carboxylase 1,ACC1)的mRNA表达调节肝脏内脂质从头合成[7-9]。肉碱棕榈转移酶1(carnitine palmitoyl transferase 1，CPT1)和肉碱棕榈转移酶2(carnitine palmitoyl transferase 2，CPT2)将脂肪酸转运入线粒体以促进脂质分解[10]。有研究表明，急性冷暴露条件下，大鼠胰岛素水平下降，血浆中游离脂肪酸含量增加，葡萄糖氧化增加[11]。同时此条件下小鼠肝脏内酮体含量增加，脂质分解基因表达增强[12-13]。持续禁食可以使肝脏内脂肪酸β氧化水平增加，为机体提供ATP并促进肝脏内糖异生[14]。目前，对于慢性冷暴露下小鼠的产热以及肝脏脂质代谢相关蛋白表达研究较少。因此，为探究慢性冷暴露对机体产热、肝脏组织结构及脂质代谢相关蛋白表达的影响，本试验根据团队前期构建的慢性冷暴露模型，对8周龄C57BL/6小鼠进行为期21 d的慢性冷暴露。冷暴露结束后检测小鼠血液葡萄糖及甘油三酯含量；观察肝脏组织形态；检测肝糖原含量以及肝脏脂质合成蛋白SREBP1和FASN，分解蛋白CPT1、CPT2，过氧化物酶体增殖物激活受体α(peroxisome proliferator activated receptor alpha, PPARα)的蛋白表达。

1 材料与方法

1.1 试剂与仪器

1.1.1 主要试剂

苏木精-伊红(HE)染色试剂盒及碘酸雪夫氏(PAS)染色试剂盒购自北京索莱宝生物科技有限公司。

RIPA裂解液、BCA蛋白浓度测定试剂盒、十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)凝胶配制试剂盒、苯甲基磺酰氟(PMSF)、SDS-PAGE蛋白上样缓冲液均购自中国碧云天生物技术有限公司；增强型化学发光试剂(ECL)显色液、聚偏二氟乙烯(PVDF)膜购自美国默克密理博公司。斯玛特生化检测试剂盘购自成都斯玛特科技有限公司。

SREBP1(14088-1-AP)、FASN(10624-20AP)、CPT1(15184-1-AP)、CPT2(26555-1-AP)、PPARα(15540-1-AP)、β-肌动蛋白(β-actin)抗体(20536-1-AP)、辣根过氧化物酶(HRP)山羊抗兔免疫球蛋白G(IgG) (SA00001-2)、HRP山羊抗鼠IgG(SA00001-1)抗体均购自Proteintech公司。

1.1.2 主要仪器

全自动生化分析仪购自成都斯马特科技有限公司；电泳槽、转膜仪、ChemiDoc XRS+化学发光成像系统均购自美国Bio-Rad公司。

1.2 试验设计

7周龄雄性C57BL/6小鼠(购自中国人民解放军军事医学科学院试验动物中心)36只，随机分为2组，即慢性冷暴露组和常温组，每组3个重复，每个重复6只小鼠。于人工气候室适应性饲养1周后进行试验。慢性冷暴露每天给予4 ℃，连续随机3 h冷刺激，冷刺激时间维持21 d，待冷刺激结束后进行样品采集；常温组饲养于(28.0±0.5) ℃人工气候室。

1.3 试验方法

1.3.1 血清葡萄糖以及甘油三酯含量测定

待冷暴露结束小鼠眼球采血。将采集血液放入真空采血管中并呈45°角倾斜放置于试管架上，室温静置1 h。3 000×g离心15 min分离血清。取100 μL血清放入生化试剂盘中进行检测。

1.3.2 HE染色

颈椎脱臼法处死小鼠，摘取小鼠肝脏并用生理盐水清洗，于4%多聚甲醛常温固24 h。将固定的肝脏组织进行常规脱水、透明、石蜡包埋，制作成厚度为5 μm的切片。二甲苯脱蜡、酒精水化、HE液染色5 min，随后脱水、二甲苯透明、树脂封片，光学显微镜观察肝脏组织病理变化。

1.3.3 PAS染色

采样、固定及切片步骤同HE染色。二甲苯脱蜡、酒精水化、高碘酸-雪弗染色，之后进行苏木素染色、脱水、二甲苯封片，光学显微镜下观察肝脏糖原分布情况,计算肝糖原含量。

1.3.4 组织蛋白提取

取80 mg肝脏组织放入EP管，置于冰上匀浆；在EP管中加入配有PMSF的裂解液，配比为PMSF∶RIPA=1∶100。之后置于冰上裂解大约0.5 h，期间对其涡旋振荡数次；裂解完毕后放入预冷4 ℃离心机，转速为12 000×g，离心10 min，取上清；对吸取的上清即提出的组织蛋白根据蛋白浓度测定说明进行浓度调节，将样品蛋白浓度调整一致；加入5×SDS-PAGE蛋白上样缓冲液并充分混匀，水浴锅煮沸10 min使蛋白变性，冷却至室温。

1.3.5 Western blot

根据SDS-PAGE凝胶试剂盒说明配制所需浓度的凝胶；将所提蛋白点入胶孔，恒压50 V进行电泳；在样品进入分离胶后恒压120 V进行电泳；之后利用湿转转膜仪将凝胶上的蛋白转印至PVDF膜，根据蛋白大小设定时间；转膜结束后脱脂乳室温封闭PVDF膜约1 h，TBST清洗3遍，10 min/次；根据条带大小孵育对应一抗，4 ℃孵育过夜，之后对PVDF膜进行清洗；室温孵育二抗，对PVDF膜进行清洗。使用ChemiDos XRS+化学发光成像系统进行曝光。

1.4 数据统计分析

PAS染色肝糖原含量使用Image J1.8.0软件统计；试验使用GraphPad Prism 8.0.2软件对数据进行t检验分析，P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著。

2 结果与分析

2.1 慢性冷暴露对小鼠肝脏组织形态的影响

图2所示为肝脏组织切片HE染色结果。由图可见，慢性冷暴露条件下小鼠肝脏组织与常温组相比视野下出现大量空泡样变。

A：常温组小鼠肝脏组织HE染色；B：慢性冷暴露组小鼠肝脏HE染色。

2.2 慢性冷暴露对小鼠血清葡萄糖及甘油三酯含量的影响

如图3-A所示，与常温组相比，慢性冷暴露条件下血清葡萄糖含量极显著降低(P<0.01);图3-B结果显示与常温组相比，慢性冷暴露条件下小鼠血清甘油三酯含量极显著下降(P<0.01)。这说明机体此时对葡萄糖以及甘油三酯的消耗大大增加，供能需求增大。

*P<0.05；**P<0.01。n=18。下图同。

2.3 慢性冷暴露对小鼠肝糖原含量影响

图4所示为小鼠肝糖原含量测定结果。由图4-C可以看出，小鼠经21 d冷刺激后，肝糖原含量较常温组显著降低(P<0.05)。这说明慢性冷暴露条件下，小鼠体内肝糖原在慢性冷暴露条件下得到动员。

A：常温组小鼠肝组织PAS染色；B：慢性冷暴露组小鼠肝组织PAS染色；C：肝糖原含量。

2.4 慢性冷暴露对小鼠肝脏脂质合成相关蛋白表达的影响

图5为脂质合成过程中FASN、SREBP1的蛋白表达水平。由图可知，经3周冷暴露后FAS、SREBP1蛋白表达水平均发生显著上调(P<0.05)。这说明肝脏经慢性冷暴露后，其合成脂质能力增强，脂质动员增加。

A：FASN、SREBP1 Western blot结果；B：FASN蛋白表达水平；C：SREBP1蛋白表达水平。

2.5 慢性冷暴露对小鼠肝脏脂质分解相关蛋白表达的影响

图6所示为脂肪分解过程中CPT1、CPT2、PPARα的蛋白表达水平。小鼠经21 d冷刺激后肝脏组织中CPT2蛋白表达水平显著升高(P<0.01)。PPARα、CPT1蛋白表达趋势与CPT2一致，经冷暴露后，其蛋白表达水平显著升高(P<0.05)。PPARα、CPT1和CPT2是脂肪分解过程中执行β-氧化功能关键蛋白，由此可知慢性冷暴露使得小鼠肝脏脂肪分解显著增加。

A： CPT1、CPT2、PPARα Western blot结果；B：CPT1蛋白表达水平；C：CPT2蛋白表达水平；D：PPARα蛋白表达水平。

3 讨论

动物机体具有复杂的生理机制，通过调控能量物质的存储与代谢来适应外界环境的变化和满足自身活动需求。当机体遭遇如禁食[15-16]、感染[17]、运动[18]等情况时，脂肪酸的β氧化会有所增加以维持能量供给。另外，外界环境中的冷热刺激也是影响动物体内能量物质代谢的重要因素。本试验对慢性冷暴露下小鼠血清葡萄糖、甘油三酯含量进行检测； HE、PAS染色检测肝脏组织病理损伤及糖原分布情况；Western blot检测肝脏脂质合成、分解过程相关蛋白表达水平。结果显示慢性冷暴露条件下小鼠肝脏与对照组相比出现空泡样变。这说明在低温刺激下，肝细胞发生肿胀并出现稳态应激负荷范围内的损伤。葡萄糖、脂质以及蛋白质并称为三大营养物质。葡萄糖和脂质之间可以进行相互转化，在肝脏组织中，葡萄糖通过糖酵解过程生成的丙酮酸可以用于DNL；同时脂质在机体功能不足情况下通过氧化分解转化成葡萄糖[19-21]。本试验发现慢性冷暴露致使小鼠血清葡萄糖含量降低，甘油三酯含量显著下降。同时肝糖原含量也降低。Yao等[22]研究发现，在急性冷暴露6 h时，小鼠血浆葡萄糖含量显著下降，这与本研究结果趋势大致相同。这说明在低温环境下，机体所需能量增加，葡萄糖消耗量增大。

甘油三酯是重要的储能物质，本试验发现慢性冷暴露下血清中甘油三酯含量显著下降，与葡萄糖含量降低一致，说明在此条件下机体能量消耗较大。肝糖原作为葡萄糖分子聚合物，是一种重要的储能形式。在禁食或空腹状态，受胰岛素和胰高血糖素调节，肝糖原分解增强[23]。经慢性冷暴露后，小鼠肝脏组织糖原含量显著降低，与Liu等[24]研究结果相符，表明慢性冷暴露条件使得小鼠肝脏内糖原分解增强。以上说明冷刺激下，小鼠血清葡萄糖含量降低，肝脏可能通过加强肝糖原分解以维持机体血糖的稳定。

本试验通过Western blot对肝脏组织内脂肪合成相关蛋白SREBP1和FASN表达水平进行检测，发现慢性冷暴露下肝脏组织内SREBP1和FASN蛋白表达水平显著增加。在营养缺乏条件下，癌细胞可以通过增加SREBP1以及FASN的表达增加脂肪的从头合成，以维持细胞的能量需求[25]。另外有研究发现SREBP1、FASN基因在冷暴露1～5 d内与常温对照组相比，表达首先发生明显下降，随着刺激天数的增加，脂质合成基因的表达较冷刺激第1天缓慢回升[26]。以上结果说明，在慢性冷暴露期间机体可能由于内环境稳态调节使得脂质合成抑制效果减弱，肝脏脂质合成因代偿需要从原本合成抑制状态变为脂质合成增加的状态。

肝脏内酰基肉碱在低温环境下可作为棕色脂肪产热的燃烧原料[27]。本试验结果显示，肝脏内用于脂质分解的CPT1蛋白表达水平显著升高；CPT2的蛋白表达水平极显著升高，说明慢性冷暴露下，小鼠肝脏内酰基肉碱分解加快，机体供能增加。PPARα是过氧化物酶体脂肪酸β氧化的限速酶，将肝脏中PPARα基因敲除可显著降低线粒体β氧化活性显著[28-29]。本研究结果显示，在慢性冷暴露条件下，PPARα蛋白表达水平变化趋势与CPT1、CPT2一致，在慢性冷暴露下表达水平上升。这说明低温环境下肝脏内脂肪酸β氧化增加，脂质分解增强。以上结果与Xu等[12,30]对低温环境下组织脂肪分解情况的研究结果相符，表明在慢性冷暴露调节下，小鼠肝脏可以通过脂肪分解增加维持能量消耗。

在畜禽养殖中，冷应激对动物生长发育、生产性能、免疫功能等方面均存在负面影响。有研究发现冷应激能够降低肉鸡平均增重，显著影响肉鸡生长性能[31]。奶牛在轻度冷应激下其年平均产奶量也会产生一定幅度的下降[32]。另外，冷应激还可以抑制绵羊血清免疫和抗氧化能力[33]。本研究中小鼠在慢性冷暴露条件下，其机体能量需求增加，肝脏脂质代谢加快，以此来适应冷应激，但长时间处于寒冷条件下势必会影响机体呼吸、血液循环、免疫系统等一系列生理活动。因此，在实际生产中，应加强饲养管理，适当添加维生素E、谷氨酰胺等抗应激剂，提高机体抗氧化功能和免疫功能，减少冷应激对机体的损伤。