三丁酸甘油酯对产肠毒素大肠杆菌K88诱发的小鼠肠道损伤的缓解作用

2022-07-11庞丽丽朱荣生王怀中王建才黄保华呼红梅

动物营养学报 2022年6期

庞丽丽朱荣生王怀中王建才齐静黄保华呼红梅*

(1.山东省农业科学院畜牧兽医研究所，济南 250100；2.国家北京药物安全评价研究中心，北京 100850)

仔猪腹泻是生产中典型的多因素疾病，也是造成仔猪死亡的主要原因。仔猪腹泻的病因和流行性病学非常复杂，产肠毒素大肠杆菌(enterotoxigenicEscherichiacoli，ETEC)是引起仔猪腹泻最常见的食源性流行病原体[1]。ETEC引起腹泻主要与菌毛黏附素和肠毒素有关，它们促进病原菌黏附于肠上皮细胞，导致机体电解质紊乱、酸碱失衡和肠道菌群失调，损伤肠道正常形态，引发炎症反应[2-3]。据统计，ETEC感染引起的仔猪腹泻在国内约占35%，在美国等其他国家约占45%，是导致生猪养殖业损失的重要因素[4-5]。目前抗生素疗法是治疗仔猪大肠杆菌性腹泻的主要措施，但是易反复和继发感染，而且易导致动物肠道菌群失衡和肠壁损伤[6]。三丁酸甘油酯(tributyrin，TB)作为丁酸前体物，因其为肠道上皮细胞供能，刺激肠上皮细胞增殖等特点而受到关注[7]，其可改善肠道黏膜的营养状态，修复抗生素、乙酸等因素导致的肠道损伤[6,8-9]。研究表明，饲粮中添加0.1%TB可促进肠道发育，提高营养物质的消化吸收[10]，维持肠道菌群平衡[11-12]，提高免疫力，促进黏蛋白分泌，进而提高畜禽生产性能[13-18]；饲粮添加0.1%TB可显著减缓乙酸和抗生素(甲硝唑、硫酸新霉素、万古霉素，每日分别给药1 g、500 mg、1 mg，连续7 d)诱发的肠道损伤[11-12]；给小鼠口服或灌肠TB，可减轻硫酸葡聚糖钠(dextran sulphate sodium，DSS)诱导的结肠黏膜损伤和炎症[19]。金霉素是治疗细菌疾病的常用抗生素，饲粮中添加75 mg/kg金霉素可显著降低仔猪腹泻，提高生长性能[20]。目前，可通过腹腔注射、鼻饲、灌服大肠杆菌的方法建立稳定的小鼠腹泻模型。ETEC作为外源菌，感染后引起动物腹泻、诱导肠道炎症发生，腹泻模型已成为研究外源菌感染诱发的肠炎、病原菌与宿主免疫系统相互关系、微生态制剂、益生菌等治疗肠炎机制的理想模型[21]。目前对于TB是否能够修复ETEC诱发的肠道损伤未见报道，为此，本试验以ETEC K88诱导建立的小鼠腹泻模型为载体，研究TB对ETEC K88诱发的小鼠肠道损伤的影响，为通过营养手段改善大肠杆菌诱发的肠道损伤，促进肠道屏障完善，减少腹泻发生提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验动物

选取体重相近的健康BCLB/c小鼠155只，体重为(20±2) g，由济南新建生物技术有限公司提供。小鼠基础饲粮由青岛可奈尔饲料有限公司提供。试验期间，试验小鼠饲养于相对湿度在30%～40%的清洁动物笼中，自由采食、饮水。垫料高压灭菌，每天更换1次。

1.1.2 ETEC K88

ETEC K88标准株(CVCC196)购自中国菌种保存中心。

1.2 试验设计

1.2.1 ETEC K88诱发小鼠腹泻模型的构建

选择体重相近的BALB/c小鼠50只，随机分为5组，每组10只。各组均饲喂基础饲粮，在第4天对照组腹腔注射无菌磷酸盐缓冲液(PBS)0.5 mL，试验1、2、3、4组分别腹腔注射浓度为5.5×108、4.9×107、4.0×106、6.5×105CFU/mL的ETEC K88悬液0.5 mL。连续观察3 d，记录小鼠的临床症状、腹泻数量和死亡数量。

1.2.2 TB对ETEC K88诱发的肠道损伤的缓解作用

选择体重相近的BALB/c小鼠105只，随机分为7组，每组3个重复，每个重复5只。空白对照组、阴性对照组饲喂基础饲粮，阳性对照组饲喂添加0.16%金霉素的基础饲粮，试验1、2、3、4组分别饲喂添加0.05%、0.10%、0.20%、0.30%TB的基础饲粮，连续饲喂14 d。在第15天，空白组腹腔注射无菌PBS 0.5 mL，阴性对照组、阳性对照组和试验1、2、3、4组按照1.2.1中确定的造模剂量腹腔注射ETEC K88悬液0.5 mL。连续观察3 d，记录小鼠的临床症状、腹泻和死亡数量，在注射后第4天采血并剖检小鼠，观察肠道病变。试验小鼠分组和处理见表1。

表1 试验小鼠分组及饲喂方案

1.3 检测指标

腹泻模型构建过程中观察小鼠精神状况、行动力、被毛、排便情况，记录腹泻、死亡数量。使用紫外分光光度计测定菌悬液在560 nm出的吸光度(OD560 nm)，确定菌悬液细菌浓度(OD560 nm=0.8时，细菌浓度约为108CFU/mL)。

在TB对ETEC K88诱发的肠道损伤的缓解作用试验中连续观察小鼠精神状况、行动力、被毛状况，记录小鼠体重、采食情况。参考Swaggerty等[22]的方法对肠道病变进行评分并制作肠道组织病理切片，采用酶联免疫吸附测定(ELISA)方法测定血清中二胺氧化酶(diamine oxidase，DAO)活性与内毒素(endotoxin，ET)、C-反应蛋白(C-reactive protein，CRP)和分泌型免疫球蛋白A(secretory immunoglobulin A，SIgA)含量。

1.4 数据统计分析

应用Graphpad prism 6.0软件对数据进行方差分析，采用LSD法进行多重比较。P<0.05为差异显著，P<0.01为差异极显著，结果均以“平均值±标准误(SE)”表示。

2 结果与分析

2.1 ETEC K88诱发小鼠腹泻模型的建立

对照组小鼠腹腔注射无菌PBS后2 h恢复行动能力，开始采食饮水，无腹泻和死亡。试验组小鼠腹腔注射ETEC K88悬液后出现不同程度的腹泻，而且被毛逆立粗乱、精神沉郁、趴窝不动、反应迟缓。试验1、2、3、4组小鼠腹腔注射ETEC K88悬液浓度分别为5.5×108、4.9×107、4.0×106、6.5×105CFU/mL，小鼠的腹泻率分别为100%、80%、20%、0%，死亡率分别为90%、20%、0%、0%，具体见表2。拟合小鼠腹泻率和死亡率曲线，根据改良寇氏法计算得知半数致死剂量(LD50)为4.9×107CFU/mL，因此选择腹腔注射4.9×107CFU/mL ETEC K88建立小鼠腹泻模型，研究TB对ETEC K88诱发的肠道损伤的缓解作用。

表2 产肠毒大肠杆菌K88对小鼠腹泻率和死亡率的影响

2.2 TB对ETEC K88诱发的小鼠肠道损伤的缓解作用

2.2.1 TB对小鼠增重的影响

由表3可知，各组试验小鼠的初始体重相近，差异不显著(P>0.05)。与阴性对照组相比，阳性对照组和试验3、4组的平均日增重显著增加(P<0.05)，分别提高了27.78%、25.00%和34.95%。阳性对照组和试验3、4组的平均日增重均显著高于试验1、2组(P<0.05)，提高了17.65%～27.85%。

表3 TB对小鼠增重的影响

2.2.2 TB对小鼠腹泻率和死亡率的影响

由表4可知，阴性对照组小鼠的腹泻率和死亡率最高，分别达到53.33%和20.00%，其他各组均无死亡。其余各组中，试验1组腹泻率最高，达到33.33%，其次为阳性对照组和试验2组，腹泻率均为26.67%，试验3、4组腹泻率均为20.00%，空白对照组无腹泻发生。由此可见，饲粮中添加TB和金霉素对ETEC K88诱发的小鼠腹泻和死亡均有较好的预防和缓解作用，其中饲粮中添加0.20%、0.30%TB时效果明显，优于添加金霉素。

表4 TB对小鼠腹泻率和死亡率的影响

2.2.3 TB对小鼠肠道组织病变的影响

剖检正常、腹泻和死亡小鼠，观察肠道病理变化，并进行评估。死亡小鼠的肠道组织损伤比腹泻小鼠严重，未发病小鼠肠道组织未见明显病变。死亡小鼠空肠达到4级病变，大面积广泛性出血；十二指肠2～3级病变，不同程度肿胀，分布出血带；盲肠直肠1级病变，有肉眼可见出血点。腹泻小鼠空肠3级病变，肉眼可见出血点，肠道有水样填充物；十二指肠1～2级病变，肠壁充盈变薄，偶见肠腔有气体；盲肠直肠0级病变，眼观无病变。由此可见，腹腔注射的ETEC K88主要侵袭肠道近端，空肠病变最严重，为此本试验进一步对腹泻小鼠(空白对照组为正常小鼠)空肠进行HE染色处理，进一步观察其形态和病理变化。

2.2.4 TB对小鼠空肠组织形态的影响

由图1可见，各组小鼠空肠损伤程度差别明显，就肠道组织完整性来看，损伤程度由大到小的顺序：阴性对照组>试验1组>阳性对照组>试验2组>空白对照组>试验4组>试验3组。与空白对照组相比，阴性对照组小鼠空肠黏膜损伤严重，肠绒毛断裂，杯状细胞、浆细胞大量浸润。与阴性对照组相比，阳性对照组和试验1、2组小鼠空肠黏膜组织较完整，肠绒毛边缘不清晰，绒毛形态较完整，可见隐窝，上皮细胞排列松散；试验3、4组小鼠肠组织结构清晰，绒毛边缘清晰、完整、排列整齐，上皮细胞排列紧密。由此可见，饲粮中添加0.20%、0.30%TB可有效减轻ETEC K88对小鼠肠道的损伤。

A：空白对照组 blank control group；B：阴性对照组 negative control group；C：阳性对照组 positive control group；D：试验1组 experimental group 1；E：试验2组experimental group 2；F：试验3组experimental group 3；G：试验4组experimental group 4。

2.2.5 TB对小鼠血清炎症相关指标的影响

由表5可知，与空白对照组相比，其他各组小鼠腹腔注射ETEC K88后血清CRP、ET含量与DAO活性均有不同程度增加，以阴性对照组增加幅度最大，分别增加了128.42%(P<0.05)、85.88%(P<0.05)和298.79%(P<0.01)，以试验3组增加幅度最小，分别增加了65.47%(P>0.05)、5.65%(P>0.05)和101.61%(P<0.01)。与阴性对照组相比，其他各组小鼠血清CRP、ET含量和DAO活性均有不同程度降低，以试验3组降低幅度最大，分别降低了27.56%(P>0.05)、43.16%(P<0.05)和49.44%(P<0.01)，其次为试验4组，分别降低了23.62%(P>0.05)、39.67%(P<0.05)和46.40%(P<0.01)。与阳性对照组相比，试验3、4组小鼠血清CRP、ET含量和DAO活性均有不同程度降低，但差异不显著(P>0.05)。试验1、2、3、4组间小鼠血清CRP、ET含量和DAO活性相近，以试验3组最低，其次为试验4组，试验2组较高，试验1组最高。试验3组小鼠血清ET含量显著低于试验1组(P<0.05)，降低了39.19%。与空白对照组相比，试验1、2、4组及阳性对照组和阴性对照组小鼠血清SIgA含量均有不同程度降低，分别降低了71.80%(P<0.01)、61.33%(P<0.05)、44.38%(P<0.05)、68.25%(P<0.05)、74.05%(P<0.01)，试验3组只在数值上降低了30.19%，差异不显著(P>0.05)。与阴性对照组相比，试验3、4组小鼠血清SIgA含量显著增加(P<0.05)，分别增加了169.00%、114.33%。与阳性对照组相比，试验3、4组小鼠血清SIgA含量显著增加(P<0.05)，分别增加了72.81%、37.69%。

表5 TB对小鼠血清炎症相关指标的影响

3 讨论

本课题组前期研究发现，在仔猪饲粮中添加0.10%～0.15%的TB可替代抗生素等药物添加剂，同时仔猪的生长性能、肠组织发育和免疫功能得到改善，添加0.20%～0.25%的TB不仅可替代抗生素等药物添加剂，而且显著提升仔猪的生长性能、养分消化率和健康水平，显著增强肠组织功能[23]。本试验主要研究TB对ETEC K88诱发的肠道损伤的缓解作用，为其在仔猪上的应用提供借鉴。

本研究发现，给小鼠饲喂添加不同水平TB的饲粮14 d后，腹腔注射ETEC K88悬液后小鼠腹泻率和死亡率均明显低于阴性对照组小鼠，其中添加0.10%TB的试验2组与阳性对照组的腹泻率和死亡率相当，添加0.20%、0.30%TB的试验2、3组的腹泻率低于阳性对照组，表明饲粮中添加TB可有效缓解ETEC K88引起的小鼠腹泻，且添加0.20%或0.30%TB时效果优于添加0.16%金霉素。腹腔注射ETEC K88后小鼠的平均日增重减少17.24%，而饲喂TB小鼠的平均日增重均有不同程度增加，其中添加0.20%和0.30%TB时平均日增重显著增加，效果与添加0.16%金霉素相当。由此可见，饲粮添加TB可缓解ETEC K88对小鼠增重的负面影响，与Hou等[9]和Wang等[24]的研究结果一致。这可能与TB可有效改善小鼠的肠道消化吸收能力和健康状态有关。

肠道黏膜不仅是营养物质消化吸收的场所，还是抵御外界病原体进入机体的屏障。本研究发现，腹腔注射的ETEC K88主要侵袭肠道近端，以空肠病变最严重，表现为肠绒毛断裂，肠腺消失，杯状细胞、浆细胞大量浸润。饲粮中添加0.20%、0.30%TB可有效缓解ETEC K88诱导产生的小鼠肠道损伤，保护肠组织结构完整，使肠绒毛边缘清晰、完整、排列整齐，隐窝清晰，肠腺明显，上皮细胞排列紧密。这与前人研究结果[25-26]一致。饲粮添加TB可改善肠炎肉鸡的肠道黏膜屏障功能，提高营养物质吸收能力[25-26]，而且TB可提高仔猪肠黏膜表皮生长因子受体(EGFR)基因的表达，通过激活EGFR信号缓解乙酸诱发的肠道损伤，使平均日增重提高13.81%[27]。抗生素可降低肠道中紧密连接蛋白的表达，以及与离子交换体、丁酸转运相关的基因和蛋白的表达，而饲粮添加TB可显著减少这些损失[6]。

SIgA是由肠黏膜上皮细胞分泌的一种关键性抗炎抗体[28]。肠道黏膜分泌SIgA是保护肠道感染的主要防御机制之一，因此被用作细菌致病性的标志指标[29]。当外界或内部抗原刺激时，肠黏膜分泌SIgA和细胞因子等物质维持肠上皮的稳态[26]。DAO是一种存在于哺乳动物小肠黏膜和肠绒毛上皮细胞中催化二胺的细胞内酶，通过调节细胞内的离子平衡、促进细胞修复保护肠道黏膜。肠道黏膜屏障功能衰竭时或肠黏膜细胞坏死时血清DAO活性升高，因此DAO活性可反映肠道损伤状态[27,30]。肠道屏障功能受损后ET转移入血，造成血液中ET含量升高，研究表明动物大肠杆菌感染后血清ET含量升高明显[31-32]。CRP是在机体受到感染或组织损伤时血浆中一些急剧上升的蛋白质(急性蛋白)[33]，细菌感染时血清CRP的含量明显升高至中等度，阳性率可达90%以上，而病毒等感染时，血清这个CRP含量多为正常或轻度升高，因此CRP含量常被用来鉴别诊断细菌感染与非细菌感染[34-35]。试验小鼠腹腔注射ETEC K88后，血清SIgA含量显著降低，DAO活性显著增加，ET、CRP含量显著升高，符合细菌感染肠道损伤后导致的炎症相关指标变化；且试验结果表明饲粮添加金霉素和TB均可有效减缓这些变化，综合比较发现饲粮添加0.20%或0.30% TB比添加0.16%金霉素的作用效果更明显。由此可见，饲粮中添加0.20%或0.30%的TB可有效缓解由ETEC K88诱导产生的小鼠肠道损伤，降低肠道的通透性，保护肠道黏膜。