宋 敏 马现永 张枫琳 王超普 苏 含 江青艳 王松波*

(1.广东省农业科学院动物科学研究所，畜禽育种国家重点实验室，农业农村部华南动物营养与饲料重点实验室，广东省畜禽育种与营养研究重点实验室，广东畜禽肉品质量安全控制与评定工程技术研究中心，广州 510640；2.华南农业大学动物科学学院，广州 510642；3.岭南现代农业科学与技术广东省实验室茂名分中心，茂名 525000；4.佛山科学技术学院生命科学与工程学院，佛山 528225)

猪去氧胆酸(hyodeoxycholic acid，HDCA)是一种天然的次级亲水胆汁酸，在猪和鼠胆汁中含量丰富，在人的胆汁中也有发现[1-2]。据报道，HDCA可以防止胆结石的形成[3-4]。此外，HDCA具有降血脂、镇痉、抑菌等多种生理作用，是一种重要的胆汁酸。作为一种胆汁酸，HDCA对动物机体的脂质代谢有着重要的调控作用。Sehayek等[2]在饲粮中添加0.05%～1.00% HDCA，发现其可能改变肠道胶束的理化性质，导致膳食胆固醇的溶解和吸收下降，对治疗小鼠血浆胆固醇含量升高和动脉粥样硬化有较好的效果，且随着HDCA含量的增加，效果也越好。Shih等[5]研究发现，饲粮中添加1.25%的HDCA能通过改善高密度脂蛋白(HDL)功能来抑制低密度脂蛋白受体(LDLR)基因敲除小鼠动脉粥样硬化的形成。Liao等[6]研究了在正常饲料和高脂饲料中分别添加以HDCA为主的猪胆汁提取物对红鳍东方鲀脂质代谢的影响，发现以HDCA为主的猪胆汁提取物能够降低饲喂正常饲料的红鳍东方鲀脂质生成基因的转录，而增加饲喂高脂饲料红鳍东方鲀的脂肪消化酶和脂质/胆固醇运输相关基因的转录。同时，2种饲料添加猪胆汁提取物后均有降低红鳍东方鲀幼鱼脂肪积累的趋势。此外，本研究团队在前期的研究中发现，饲粮添加1 000 mg/kg的HDCA使断奶仔猪的血清甘油三酯含量显著降低，末重和平均日增重与对照组相比分别降低了3.76%和6.00%，且料重比显著升高[7]，提示HDCA可能影响动物机体的脂肪消化吸收与沉积。脂肪组织是人和动物机体储存和提供能量的主要组织，对维持机体的糖、脂代谢稳态和能量代谢平衡至关重要。同时，脂肪组织也是内分泌器官，能够分泌多种脂肪因子和激素来调节脂质代谢和能量平衡[8]。然而目前，关于HDCA对动物机体脂肪沉积方面的影响却鲜见报道。脂肪的消化吸收和能量代谢是影响脂肪沉积的重要因素。因此，本试验以小鼠为研究对象，探讨HDCA对小鼠生长性能、褐色脂肪组织(BAT)和机体产热以及呼吸熵等能量代谢、脂肪消化吸收方面的影响，为HDCA在动物生产中的应用提供基础和理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与材料

20只3周龄雄性无特定病原体(SPF)级C57BL/6J小鼠和基础饲粮均购于广东省医学实验动物中心。按体重将小鼠随机分为2组，分别为对照组和HDCA组。对照组小鼠饲喂基础饲粮，HDCA组小鼠饲喂基础饲粮+1.5% HDCA的试验饲粮(HDCA的添加量由前期仔猪饲养试验结果和小鼠预试验结果确定，且此剂量对小鼠机体的正常代谢无显著影响)，分笼饲养在温度(24±1) ℃、湿度60%左右、光照与黑暗各12 h的环境中，自由采食和饮水，每周记录小鼠的采食量，试验期为10周。基础饲粮组成及营养水平见表1。HDCA购买于杭州某生物科技有限公司，含量为98%。

表1 基础饲粮组成及营养水平(干物质基础)

1.2 测定指标及方法

1.2.1 生长性能和脂肪含量的测定

试验开始和结束时对小鼠进行空腹称重，试验期间记录小鼠的采食量。试验结束后计算小鼠的体增重和平均日采食量(ADFI)。通过颈部脱臼方式处死小鼠，采集小鼠附睾脂肪组织(eWAT)、皮下脂肪组织(sWAT)及BAT并称重，计算eWAT、sWAT及BAT的含量。

1.2.2 BAT产热和基础代谢的测定

试验第9周，采用红外热成像仪(美国菲力尔公司)测定小鼠在25和4 ℃环境温度下的BAT产热。采用代谢笼检测系统(上海科之蓝仪器有限公司)对小鼠的基础代谢监测24 h，分析小鼠的呼吸熵和产热等代谢参数。

1.2.3 小鼠1周能量摄入和排出粪便能量的测定

试验第10周，记录小鼠1周采食量，收集小鼠1周排出的全部粪便，105 ℃烘箱中烘干至恒重后称重，粉碎，过40目筛，用于测定粪便的能值和粗脂肪含量。同时，收集2种饲粮并测定其能值和粗脂肪含量。饲粮和粪便能值用Parr-6400氧弹量热仪测定，粗脂肪含量参照GB/T 6433—2006测定。按照以下公式计算小鼠1周能量摄入和排出粪便的能量：

小鼠1周能量摄入(kJ)=饲粮能值×小鼠1周采食量；小鼠1周排出粪便能量(kJ)=粪便能值×小鼠1周排出粪便总重量。

1.2.4 粗脂肪表观消化率的测定

采用内源指示剂—盐酸不溶灰分法进行粗脂肪表观消化率的测定，饲粮和粪便中盐酸不溶灰分含量参考GB/T 23472—2009测定。粗脂肪表观消化率的计算公式如下：

粗脂肪表观消化率(%)=100-100×(b×c)/(a×d)。

式中：a为饲粮中粗脂肪的含量；c为饲粮中盐酸不溶灰分的含量；b为粪样中粗脂肪的含量；d为粪便中盐酸不溶灰分的含量。

1.2.5 胰脂酶mRNA相对表达量的测定

采集小鼠胰腺，按照HiPure Total RNA Mini kit试剂盒(广州美基生物科技有限公司)说明书，使用Trizol试剂对小鼠胰腺组织的总RNA进行提取。采用Synergy 2型多功能酶标仪(美国BioTek公司)测定RNA浓度，根据260与280 nm处吸光度的比值判断其纯度。利用逆转录试剂盒(大连TaKaRa公司)逆转录合成cDNA。取0.25 μL上游引物，0.25 μL下游引物，6.5 μL无核酸水，3 μL cDNA和10 μL的SYBR Green Master Mix，混合成20 μL的体系。以β-肌动蛋白(β-actin)为内参，使用荧光定量PCR仪(美国Stratagene公司)通过其特异性引物扩增目的基因mRNA。用Primer 5.0软件设计各基因PCR特异性引物，引物序列如表2所示，引物由上海生物工程有限公司合成。反应程序为：95 ℃预变性2 min；然后进入扩增循环，95 ℃变性15 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40个循环。根据公式2-ΔΔCt计算出目的基因的mRNA相对表达量。

表2 实时荧光定量PCR引物序列

1.3 统计分析

采用Sigmaplot 12.5软件进行统计分析，采用独立样本t检验统计比较2组数据间的差异，P<0.05和P<0.01分别代表差异显著和差异极显著。

2 结果与分析

2.1 HDCA对小鼠生长性能的影响

由表3可知，与对照组相比，饲粮添加HDCA对小鼠的ADFI和终末体重无显著影响(P>0.05)，但显著降低了小鼠的体增重(P<0.05)。此外，饲粮添加HDCA对小鼠eWAT含量和BAT含量无显著影响(P>0.05)，但却显著减少了小鼠的sWAT含量(P<0.05)，提示饲粮添加HDCA可能影响小鼠的皮下脂肪生成和沉积，从而降低了体增重。

表3 饲粮中添加HDCA对小鼠生长性能的影响

2.2 HDCA对小鼠能量代谢的影响

如图1-A、图1-B所示，与对照组相比，在25和4 ℃环境温度下，饲粮添加HDCA均能增加小鼠的BAT温度，即产热(P<0.05)。同时，基础代谢试验结果显示，HDCA能极显著降低小鼠白天和黑夜的呼吸熵(P<0.01)(图1-C、图1-D)，并增加小鼠的机体产热(P<0.05和P<0.01，图1-E、图1-F)，从而提高了小鼠的基础代谢。以上结果表明，HDCA能提高小鼠的能量代谢。

A和B：饲粮添加HDCA对小鼠BAT温度的影响；C和D：饲粮添加HDCA对小鼠呼吸熵的影响；E和F：饲粮添加HDCA对小鼠产热的影响。*、**分别表示与对照组相比差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。

2.3 HDCA对小鼠脂肪消化吸收的影响

如图2-A、图2-B所示，与对照组相比，HDCA组小鼠的1周能量摄入没有显著差异(P>0.05)，但却显著增加了由粪便排出的能量(P<0.01)。同时，HDCA组小鼠粪便的粗脂肪含量极显著升高(P<0.01)，粗脂肪表观消化率极显著降低(P<0.01；图2-C、图2-D)。此外，由图2-E可知，饲粮添加HDCA有降低小鼠胰腺胆盐刺激性脂酶(bile salt-stimulated lipase，BSSL)、磷脂酶A2(pancreatic phospholipase A2，PLA2)、甘油三酯脂酶(pancreatic triglyceride lipase，PTL)、胰脂酶相关蛋白1(pancreatic lipase-related protein 1，PLRP1)和胰脂酶相关蛋白2(PLRP2)mRNA表达量的趋势(0.05≤P<0.10)。以上结果表明，饲粮添加HDCA能够降低小鼠肠道内脂肪的消化吸收。

A：饲粮添加HDCA对小鼠1周能量摄入的影响；B：饲粮添加HDCA对小鼠1周排出粪便能量的影响；C：饲粮添加HDCA对小鼠粪便中粗脂肪含量的影响；D：饲粮添加HDCA对小鼠粗脂肪表观消化率的影响；E：饲粮添加HDCA对小鼠胰腺中胆盐刺激性脂酶(BSSL)、磷脂酶A2(PLA2)、甘油三酯脂酶(PTL)、胰脂酶相关蛋白1(PLRP1)和2(PLRP2)的mRNA相对表达量的影响。**表示与对照组相比差异极显著(P<0.01)。

3 讨 论

3.1 HDCA对小鼠生长性能的影响

Watanabe等[1]研究发现，在高热量饲粮中添加0.3%的HDCA饲喂小鼠4周对其采食量和末重无显著影响。而本试验结果表明，饲粮添加1.5%的HDCA对小鼠的采食量和终末体重无显著影响，但显著降低了小鼠的体增重。造成这种差异的原因可能是小鼠饲粮类型、HDCA饲喂量以及饲养时间的不同。有研究表明，饲粮中添加HDCA能够治疗小鼠血浆胆固醇含量升高和动脉粥样硬化，且在0.05%～1.00% HDCA范围内，HDCA含量越高，效果越好[2]，说明HDCA的剂量能够影响试验效果。在生长性能方面，与本试验结果类似，Shih等[5]发现在饲粮中添加1.25%的HDCA使LDLR基因敲除小鼠的脂肪含量降低，且体重比对照组降低了10%，然而小鼠的血清生理生化结果表明，HDCA的添加并没有提高血清中任何器官毒性标志物的水平。相反，添加HDCA的小鼠血清中的肝脏毒性标志物，如总胆红素含量及天冬氨酸氨基转移酶(AST)、乳酸脱氢酶(LDH)和γ-谷氨酰基转移酶(GGT)活性均显著低于对照组，说明在饲粮中添加1.25%左右的HDCA并不会影响小鼠的整体健康水平。此外，前期试验结果也发现，饲粮添加1 000 mg/kg的HDCA使断奶仔猪的终末体重和ADG比对照组分别降低了3.76%和6.00%，这可能跟肠道中与体重增加和肝脏中甘油三酯含量呈负相关的副拟杆菌属(Parabacteroides)的相对丰度升高有关[7]。而本试验中HDCA组小鼠体增重的降低是否跟肠道中Parabacteroides相对丰度有关则需要进一步的验证。此外，本试验发现HDCA对小鼠的eWAT和BAT含量无显著影响，但却显著减少了小鼠的sWAT含量，说明HDCA组小鼠体增重的降低可能跟小鼠皮下脂肪沉积的减少有关。

3.2 HDCA对小鼠能量代谢的影响

机体能量代谢水平是影响脂肪沉积的重要因素。因此，本试验通过测定小鼠的BAT产热和基础代谢来研究HDCA对小鼠机体能量代谢的影响。试验结果显示，饲粮添加HDCA能够增加25和4 ℃环境温度下小鼠的BAT产热。同时，HDCA还能降低小鼠的呼吸熵并增加小鼠机体产热。以上结果说明，HDCA能够通过增加BAT产热和基础代谢提高小鼠的能量代谢，从而降低小鼠的sWAT含量。多项研究表明，胆汁酸可作为信号分子，通过激活胆汁酸体参与机体的能量代谢等调节过程[9]。Watanabe等[10]发现，G蛋白偶联胆汁酸受体5(TGR5)激活后能提高细胞内甲状腺激素活性，从而增加了BAT产热，逆转了高脂饮食诱导的肥胖和BAT中的脂肪沉积。Broeders等[11]的研究也表明，鹅去氧胆酸能通过TGR5促进人类BAT的线粒体解偶联，并增加了12名健康女性BAT的活性和全身的能量消耗[12]。此外，还有研究发现，肝内法尼醇X受体(FXR)的激活也可能影响全身能量稳态。因此，HDCA提高小鼠的能量代谢可能跟小鼠体内胆汁酸受体的激活有关。

3.3 HDCA对小鼠脂肪消化吸收的影响

Watanabe等[1]的研究表明，HDCA能够下调小鼠肝脏中脂肪酸从头合成和饱和脂肪酸的去饱和相关酶的基因表达水平。同时，HDCA能够降低小鼠的血清总脂肪酸、肝脏胆固醇酯和肝脏甘油三酯的含量，从而发挥降血脂作用。此外，Liao等[6]研究发现，以HDCA为主的猪胆汁提取物能够增加饲喂高脂饲料红鳍东方鲀的脂肪消化酶和脂质/胆固醇运输相关基因的转录。与前人的研究结果相一致，本试验结果显示，HDCA在未影响小鼠能量摄入的前提下，降低了小鼠的粗脂肪表观消化率，从而增加了小鼠粪便中的粗脂肪含量和能量。此外，HDCA还有降低小鼠胰腺胰脂酶相关基因BSSL、PTL、PLA2、PLRP1及PLRP2 mRNA相对表达量的趋势。BSSL和PLRP2是人类和动物在新生儿阶段的主要胰脂酶，两者协同作用，能够更高效地水解甘油三酯、胆固醇及磷脂，有利于肠道细胞对脂肪的吸收，对断奶前的生长发育起着至关重要的作用[13]。PTL和PLA2则是断奶后和成年期乳脂颗粒中水解甘油三酯的主要胰脂酶，哺乳期的胰腺几乎不表达PTL和PLA2，直到断奶后才能检测到，并逐渐增加至成年期水平[14]。PLRP1本身并没有脂解作用，它可能通过与PLRP2和PTL竞争性结合辅酶而间接影响脂肪的消化吸收[15]。本试验结果表明，HDCA可能通过下调生命早期和成年期胰脂酶相关基因表达水平来减少小鼠对脂肪的消化吸收，从而降低小鼠的体增重和皮下脂肪沉积。

4 结 论

饲粮添加1.5%的HDCA能够增加小鼠BAT和机体产热，降低呼吸熵，提高能量代谢，同时减少小鼠对脂肪的消化吸收，从而降低小鼠的sWAT含量和体增重。