王 桃 曹 璐 米晓钰 吕 琛 赵兴绪 张 勇*

(1.甘肃农业大学动物医学院，兰州 730070；2.甘肃省动物生殖生理及繁殖调控重点实验室，兰州 730070)

奶牛乳房炎是指奶牛的乳腺组织受到机械性刺激、病原微生物侵入及物理化学性损伤所导致的乳房实质、间质性炎症[1]。其中，引起奶牛乳房炎的主要细菌为金黄色葡萄球菌[2]，当有细菌感染时，奶牛乳腺上皮细胞会发生不同程度的病理损伤，严重时可导致牛奶品质和产量下降[3]，给养殖业带来巨大的经济损失。目前，临床上治疗奶牛乳房炎的常规方法有抗生素治疗，也有核酸疫苗[4]、乳酸菌治疗[5]等报道，但尚在尝试阶段。而抗生素治疗明显存在细菌耐药性增加、抗生素残留、弃奶期长等弊端。在国家2020年实施的“饲料端禁抗”、“养殖端限抗”、“食品端无抗”的战略下，由于中药开发出的饲料添加剂、复方提取液等纯天然，绿色无污染、无残留，故而以中兽药为主的兽用替抗产品的研发及应用成为畜牧业生产和动物疾病防治的重要方向。

研究报道，槲皮素有消炎解热的作用，且对金黄色葡萄球菌极度敏感[6]。槲皮素，又称栎精，广泛存在于植物的花、叶、果实中[7]，具有抗炎[8]、抗菌、抗氧化等多种药理学活性[9]。槲皮素具有调节炎症的药理作用，可降低白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-6(IL-6)等炎症因子的表达量而达到抗炎效果[10]。通过调控磷脂酰肌醇-3-羟激酶(PI3K)/蛋白激酶(AKT)/核转录因子-κB(NF-κB)信号通路来改善非酒精性脂肪性肝炎大鼠的肝脏组织脂肪变性程度，从而达到抗炎的效果[11]。本研究利用实验室前期从罹患奶牛乳房炎的奶牛乳样中分离得到的金黄色葡萄球菌，通过构建小鼠金黄色葡萄球菌乳腺炎模型，同时给予不同剂量的槲皮素进行干预治疗，观察其在疾病的发展过程中对小鼠乳腺炎的作用，并以肿瘤坏死因子(TNF)信号通路为靶点探讨其作用机制。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 试验药物与菌株

槲皮素，纯度98%，批号:Yz051621，购自南京某生物技术有限公司。金黄色葡萄球菌来源于宁夏吴忠地区罹患乳房炎奶牛的乳样，由本实验室分离鉴定，并于-80 ℃保存。

1.1.2 试验动物

清洁级小鼠135只(雌鼠90只，雄鼠45只)，7～8周龄，体重28～35 g，购自兰州大学实验动物中心。常规标准饲料饲喂，自由饮水，每3～5 d更换1次垫料，适应性饲养1周后试验。试验过程中所有操作均遵守试验动物伦理原则。

1.1.3 试剂与仪器

试剂：Thermo Scientific RevertAid第1链cDNA合成试剂盒(赛默飞世尔科技中国有限公司)、TransStart Top Green qPCR Super Mix(北京全式金生物技术有限公司)、兔源肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、IL-6、IκB激酶β(IKKβ)、兔源NF-κB抗体(北京博奥森生物技术有限公司)等。

仪器：实时荧光定量PCR仪器(伯乐生命医学产品有限公司)、凝胶成像系统(伯乐生命医学产品有限公司)等。

1.2 试验方法

1.2.1 小鼠乳腺炎模型的建立和指标检测

取金黄色葡萄球菌菌株20 μL接种于适量的液体培养基中，37 ℃摇床过夜。采用等比稀释法稀释后，接种于营养琼脂培养基，涂抹平板计数法计算菌液浓度。小鼠性成熟后，腹腔注射孕马血清促性腺激素，同期发情后按照雌雄2∶1的比例进行合笼繁殖，雌鼠90只，雄鼠45只。随后按解剖时间不同将90只泌乳期母鼠分为3大组，每大组共30只母鼠，再将各大组母鼠分为5小组，每组6只，分别为空白对照组(乳部皮内注射生理盐水100 μL)、模型组(乳部皮内注射1.9×105CFU/mL菌液100 μL)、高剂量组(乳部皮内注射1.9×105CFU/mL菌液100 μL后，再用200 mg/kg槲皮素灌胃治疗)、中剂量组(乳部皮内注射1.9×105CFU/mL菌液100 μL后，再用100 mg/kg槲皮素灌胃治疗)和低剂量组(乳部皮内注射1.9×105CFU/mL菌液100 μL后，再用50 mg/kg槲皮素灌胃治疗)。接种后，分别在治疗第3、5、7天无菌条件下采集小鼠血液，进行血液生理指标检测;随后颈椎脱臼处死，取乳腺组织，一侧于4%中性组织固定液中固定，另一侧于-80 ℃保存备用。

1.2.2 血液生理指标检测

无菌条件下采用眼眶后静脉丛采血法采集全血，用五分类全自动血细胞分析仪对血液中白细胞、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞的数量进行检测。

1.2.3 组织病理学观察

将固定组织常规方法制作石蜡切片。经二甲苯脱蜡，梯度酒精脱水，苏木精染色，盐酸分化液分化，伊红染色，梯度酒精脱水，二甲苯透明，树胶封片。随机选5个视野，镜下对组织进行病理学观察。

1.2.4 实时荧光定量PCR(qRT-PCR)

取1 mg小鼠乳腺组织加入液氮研磨后，提取总RNA，测定总RNA浓度。按Thermo Scientific RevertAid第1链cDNA合成试剂盒操作说明合成cDNA。根据NCBI中小鼠IKKβ(NM_001159774.1)、核因子抑制蛋白α(IKBα)(AF112979.1)、NF-κB(NM_026689.3)和磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)(NM_001289726.1)(管家基因)的序列，设计特异性引物，引物序列信息见表1，由生工生物工程股份有限公司合成。qRT-PCR检测IKKβ、IKBα、NF-κBmRNA相对表达量。反应体系为20 μL:2×TransStart Top Green qPCR Super Mix 10 μL，上、下游引物各0.5 μL，cDNA 1 μL，ddH2O 8 μL。反应程序采用三步法:95 ℃ 30 s，95 ℃ 30 s，57 ℃ 34 s，72 ℃ 25 s;共45个循环。每个样品重复3孔，反应结束后观察扩增曲线和熔解曲线，计算Ct值。采用2-△△Ct法计算目的基因mRNA相对表达量。

表1 引物序列信息

1.2.5 蛋白质免疫印迹(Western blot)

取100 mg乳腺组织加液氮研磨后，加入1 mL RIPA裂解液，于4 ℃中裂解30 min，在4 ℃下12 000 r/min离心30 min，轻轻吸取上清液于新管中，置于-80 ℃保存备用。Bradford G250法测定总蛋白浓度，定量后与蛋白上样缓冲液混合，金属浴95 ℃变性5 min，置于-20 ℃保存备用。取蛋白样品，经5%浓缩胶和12%分离胶电泳后，将蛋白转移至聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上，5%脱脂奶粉室温摇床封闭2.5 h，加兔源TNF-α(1/300)和IL-6(1/300)、IKKβ(1/300)、NF-κB(1/300)、GAPDH(1/3 000)抗体，4 ℃孵育过夜，辣根过氧化物酶(HRP)标记的二抗(1/5 000) 37 ℃孵育1.5 h。超敏发光液进行显影，多功能成像仪进行拍照。Image-J软件分析灰度值。

1.3 统计学分析

采用SPSS 24.0分析数据，使用“平均值±标准差”表示。多组平均值比较采用单因素方差分析，组间两两比较选用独立样本t检验法。P<0.05表示差异具有显著性，P<0.01表示差异具有极显著性。

2 结果与分析

2.1 生存状况观察结果

空白对照组小鼠表现为反应灵活、皮毛浓密有光泽、活动度正常。模型组小鼠表现为眯眼、被毛杂乱失泽。各剂量组小鼠在治疗期间少食、消瘦倦卧、体重逐渐减轻，尤其以高剂量组小鼠生存状况得到明显改善，其余剂量组小鼠生存状况均有所改观，基本恢复正常。

2.2 金黄色葡萄球菌感染小鼠乳腺组织的形态学病理变化

如图1所示，空白对照组乳腺上皮细胞排列规则，边缘圆润，结构完整，轮廓清晰；模型组乳腺上皮细胞大量脱落至管腔内，边缘严重变性；高剂量组在治疗第3天时，乳腺上皮细胞内分泌物减少，细胞排列不整齐，有红细胞渗出，治疗第5天时，有少量炎性细胞和红细胞渗出，治疗第7天时，乳腺上皮细胞排列规整，间质中散在少量红细胞；中剂量组在治疗第3天时，乳腺上皮细胞少量脱落，伴随脂肪浸润，治疗第5天时，有少量红细胞渗出，治疗第7天时，乳腺上皮细胞基本排列规整，但依有少量红细胞；低剂量组在治疗第3天时，乳腺上皮细胞扭曲变形，大量上皮细胞脱落，大量红细胞聚集，在间质中存在淋巴细胞等炎性细胞，治疗第5天时，导管官腔变形，大量脂肪浸润，治疗第7天时，仅有少量脂肪浸润。

A：治疗第3天；B：治疗第5天；C：治疗第7天；1：空白对照组；2：模型组；3：高剂量组；4：中剂量组；5：低剂量组。 → :乳腺上皮细胞； ：脂滴；★：分泌物； ：出血部位；：淋巴细胞。

2.3 金黄色葡萄球菌感染小鼠的血液生理指标检测结果

由表2可知，感染金黄色葡萄球菌后，模型组血液中白细胞、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞数量均极显著高于空白对照组(P<0.01)，在治疗第3、5天，中剂量组的白细胞、淋巴细胞、单核细胞和中性粒细胞数量显著下降(P<0.05)，高、低剂量组无显著差异(P>0.05)；在治疗第7天，高剂量组的白细胞和中性粒细胞的数量显著下降(P<0.05)，低剂量组的淋巴细胞和单核细胞数量显著下降(P<0.05)，中剂量组无显著差异(P>0.05)。

表2 金黄色葡萄球菌感染小鼠的血液生理指标的变化

2.4 槲皮素对金黄色葡萄球菌乳腺炎小鼠乳腺组织NF-κB、IKKβ及IκBα mRNA相对表达量的影响

如图2所示，在NF-κBmRNA的相对表达量，与模型组相比，除治疗第7天与低剂量组差异不显著(P>0.05)外,其余剂量组均显著降低(P<0.05)。各剂量组间比较发现，治疗第3、7天时，高、中剂量组差异不显著(P>0.05)，治疗第5天时，各剂量组间差异显著(P<0.05)。

NF-κB：核转录因子-κB nuclear transcription factor-κB；IKKβ：IκB激酶β IκB kinase β；IKBα：核因子抑制蛋白α nuclear factor inhibitory protein α。

在IKKβmRNA的相对表达量，与模型组相比，除治疗第3天与低剂量组差异不显著(P>0.05)，高、中剂量组差异不显著(P>0.05)外，其余各剂量组均显著降低(P<0.05)。各剂量组间比较发现，治疗第5、7天时，各剂量组间差异显著(P<0.05)。

在IκBαmRNA的相对表达量，与模型组相比，除治疗第7天与低剂量组差异不显著(P>0.05)外，其余各剂量组均显著降低(P<0.05)。各剂量组间比较发现，治疗第3天时，各剂量组间差异不显著(P>0.05)，治疗第7天时，高、中剂量组差异不显著(P>0.05)，治疗第5天时，各剂量组间差异显著(P<0.05)。

2.5 槲皮素对金黄色葡萄球菌小鼠乳腺组织IL-6、TNF-α、IKKβ及NF-κB蛋白相对表达量的影响

如图3所示，在IL-6蛋白相对表达量，在治疗第3、5、7天时，模型组与低剂量组差异不显著(P>0.05)；各剂量组比较发现，在治疗第3、5天时，各剂量组间差异不显著(P>0.05)，治疗第7天时，各剂量组间差异显著(P<0.05)。

IL-6：白细胞介素-6 interleukin-6；TNF-α：肿瘤坏死因子-α tumor necrosis factor-α；IKKβ：IκB激酶β IκB kinase β；NF-κB：核转录因子-κB nuclear transcription factor-κB；GAPDH:磷酸甘油醛脱氢酶 phosphoglyceraldehyde dehydrogenase。

在TNF-α蛋白的相对表达量，在治疗第3、5、7天时，模型组与中、低剂量组差异不显著(P>0.05)；各剂量组比较发现，高剂量组与中、低剂量组差异显著(P<0.05)。

在IKKβ蛋白的相对表达量，与模型组相比，除治疗第5天与中、低剂量组差异不显著(P>0.05)外，治疗第3、7天时，模型组与剂量组差异显著(P<0.05)。各剂量组比较发现，治疗第3、7天时，各剂量组间差异显著(P<0.05)。

在NF-κB蛋白的相对表达量，在治疗第3、7天时，模型组与低剂量组差异不显著(P>0.05)，在治疗第5天时，模型组与剂量组差异显著(P<0.05)。各剂量组比较发现，治疗第3天时，高、中剂量组差异不显著(P>0.05)，治疗第5天时，各剂量组间差异不显著(P>0.05)，治疗第7天时，各剂量组间差异显著(P<0.05)。

3 讨 论

奶牛乳房炎是一种复杂的乳腺综合性疾病[12]，在国外养殖场发病率均高。在国外奶牛乳房炎的平均发病率为25%～60%，在国内奶牛乳房炎的发病率为20%～75%，有些地区的发病率甚至超过75%[13]，世界每年在治疗奶牛乳房炎上的花费高达300亿元，造成了巨大的经济损失。目前，我国约90%的奶牛乳房炎是由大肠杆菌和葡萄球菌引起的[14]，且呈现出明显的地域差异性[15-17]。天然药物和中药有效成分因其作用靶点多、安全性高等特点，被视为是高效低毒的有效抗炎药物，在实际生产中已有许多中药被制成饲料添加剂用于提高动物的免疫力。研究表明，金银花提取物、雪白睡莲花粗提物、白头翁皂苷及白头翁皂苷等多种中药提取物对奶牛乳房炎均有防治作用[18-21]。其中，枸杞多糖、栀子苷、姜黄素、蒲公英甾醇等有效成分也可通过降低TNF-α、IL-1、IL-6等炎症因子的mRNA的相对表达量而达到抗炎效果[22-25]。

槲皮素广泛存在于果蔬中，调节炎症是其主要的药理作用之一，有许多体内、体外的试验已验证其抗炎作用，研究表明，在体内，通过槲皮素处理脂多糖诱导的小鼠巨噬细胞瘤细胞系细胞炎症模型，测定发现槲皮素可通过降低炎症因子IL-1、IL-6、白细胞介素-10(IL-10)的mRNA相对表达量而达到抗炎症的效果[10]，在小鼠体外肺炎模型中发现槲皮素可以通过抑制IKKβ/NF-κB等炎性因子的mRNA相对表达量从而达到抗炎的作用[26]。本试验设计不同剂量组，不同剂量的槲皮素对乳腺组织均有保护作用，减轻了乳腺上皮细胞的损伤，抑制了IKKβ、IKBα、NF-κB炎性因子的mRNA相对表达量，提示槲皮素在治疗奶牛乳房炎上的可能性。

从病理组织学角度来看，空白对照组的乳腺上皮细胞饱满圆润，攻菌处理后的乳腺上皮细胞出现大量脱落，间质中还有红细胞的渗出和聚集，经过不同剂量的槲皮素干预后，高剂量组的乳腺上皮细胞相比中、低剂量组得到明显恢复，但仍有少量红细胞渗出，说明槲皮素可以通过修复受损的细胞从而达到恢复组织功能的目的。血液生理指标中白细胞数量是主要的炎症判定指标。在本试验中血常规结果显示，空白对照组的各项指标均在正常值范围；模型组中白细胞数量显著高于空白对照组，表明小鼠乳腺炎模型成功构建；在剂量组间相比较，高剂量组的各项指标与空白对照组最为接近，高剂量的槲皮素对小鼠乳腺炎的治疗效果相对较好，说明槲皮素可以通过减少炎性细胞的数量从而达到降低炎症的效果。通过血液生理指标和病理切片结果两者结合，以及与吕琛等[27]研究结果基本一致，由此判断出小鼠乳腺炎模型建立完成。炎性细胞因子的异常表达也是判定炎症的重要条件之一，TNF信号通路是重要的炎症通路之一[28]，可激活含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶、c-Jun氨基末端激酶和NF-κB 3条信号通路及NF-κB的主要细胞因子，同时还能诱导细胞凋亡和坏死[29-30]，参与金黄色葡萄球菌感染乳腺炎的整个病理过程。TNF-α是机体最主要的促炎因子，可以激活TNF信号通路，诱导多种炎症介质释放[31-32]。IL-6是一种重要的炎症因子，可以诱导多种急性反应蛋白产生，在机体的免疫炎症反应中发挥重要作用[33]。同时，IL-6又能够通过gp130转录信号传导与转录激活因子3(STAT3)进行信号转导，引起NF-κB信号通路活化并启动TNF-α、IL-1β等促炎因子的mRNA的表达，最终导致炎症反应级联放大[34]。核转录因子抑制蛋白复合物是调节NF-κB/Rel的一个重要环节，主要参与炎症和免疫反应以及增殖和凋亡[35]。IKKβ磷酸化后激活IKBα，从而激活下游的NF-κB炎症信号通路，使其产生级联放大效应。

本研究结果显示，攻菌后模型组小鼠乳腺组织中IKBα、NF-κBmRNA相对表达量显著升高，IKKβmRNA相对表达量升高；TNF-α、IL-6蛋白相对表达量显著升高，IKKβ、NF-κB蛋白相对表达量升高；给予槲皮素后，IKBα、NF-κBmRNA相对表达量显著降低，IKKβmRNA相对表达量降低；NF-κB蛋白相对表达量显著降低，TNF-α、IL-6蛋白相对表达量下降。这说明槲皮素能抑制TNF信号通路，降低IKBα、IKKβ、NF-κBmRNA相对表达量以及TNF-α、IL-6、IKK、NF-κB蛋白相对表达量，从而发挥抗炎的作用，且呈明显的剂量依赖性。

4 结 论

综上所述，槲皮素可能通过下调TNF信号通路的活性，减少炎症因子的表达，改善乳腺组织的损伤，从而对感染金黄色葡萄球菌的小鼠乳腺组织产生保护作用。