曹 实 杨霖坤 鲁康乐 张春晓 王 玲 李学山 宋 凯

(集美大学水产学院，厦门市饲料检测与安全评价重点实验室，厦门 361021)

花鲈(Lateolabraxmaculatus)又称海鲈、七星鲈、寨花，属鲈形目，真鲈科，花鲈属，是广温广盐性鱼类，分布于中国、韩国及日本的近岸浅海，在我国的山东、浙江、福建、广东等沿海地区均有分布[1]。花鲈具有生长速度快、营养价值高、肉质鲜美、抗病性强等特点，为我国重要经济养殖品种之一[2]。根据《2020中国渔业统计年鉴》的报告，2019年我国花鲈产量18.02万t[3]。

近年来，随着水产养殖业快速发展，养殖总量逐年攀升，对鱼粉的需要量越来越大，而受到海洋环境恶化和厄尔尼诺现象的影响，鱼粉产量下降，导致鱼粉供不应求，且价格居高不下，因此寻求合适的蛋白质源替代鱼粉成为行业内研究热点。大豆具有蛋白质含量高、氨基酸种类丰富、产量高、价格低等优点，为水产饲料中常见的植物蛋白质源之一[4]。但是大豆中存在多种抗营养因子，如抗原蛋白(大豆球蛋白、β-伴大豆球蛋白)、胰蛋白酶抑制因子、凝集素、植酸和皂苷等，对水产动物的生长产生不利影响，如干扰动物肠道的生理功能、降低对营养物质的消化吸收，在幼龄动物中可导致腹泻甚至死亡[5-6]。因此，降低大豆蛋白的抗营养因子水平是难点之一。酶解大豆分离蛋白是大豆蛋白通过降解工艺生产，不仅可以降低抗营养因子的毒性，而且富含的多肽易被动物消化吸收，从而提高其适口性与营养物质消化率[7-8]。同时也有一些研究发现酶解大豆分离蛋白中的大豆多肽通过影响高密度脂蛋白受体(LDL-R)的转运以及抑制肝细胞中脂蛋白分泌、甾醇生物合成等调节脂肪代谢[9-10]。因此，本试验通过研究酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈生长性能、血清生化指标和脂肪代谢的影响，为大豆蛋白在花鲈等肉食性鱼类饲料中的利用提供依据，以及为节约鱼粉资源、降低饲料成本、发展绿色健康的花鲈养殖业提供理论指导。

1 材料与方法

1.1 试验材料

本试验的酶解大豆分离蛋白(粗蛋白质含量约为82.7%)是由大豆分离蛋白经过碱性蛋白酶和木瓜蛋白酶等复合酶水解制成(料水比1∶20，pH=8.5，50 ℃，作用时间4 h)。经大豆球蛋白检测试剂盒和β-伴大豆球蛋白检测试剂盒检测(北京龙科方舟生物工程技术有限公司)，大豆分离蛋白酶解结果见表1。

表1 大豆分离蛋白酶解结果

1.2 试验设计和饲料

将225尾初始体重为(9.0±0.5) g的花鲈随机分为3组，每组3个重复，每个重复25尾鱼。根据之前大豆蛋白替代鱼粉在花鲈上的研究结果[11-12]，将试验鱼分为鱼粉组(FM组)、酶解大豆分离蛋白替代25%鱼粉组(ESPI25组)、酶解大豆分离蛋白替代50%鱼粉组(EPSI50组)。根据花鲈的营养需求，以鱼粉、酶解大豆分离蛋白、鸡肉粉和谷朊粉为蛋白质源，以鱼油、豆油和卵磷脂为脂肪源，配制3种等氮等脂的饲料。另用晶体氨基酸调平蛋氨酸与赖氨酸，以三氧化二钇作为外源指示剂。试验饲料组成及营养水平见表2。

表2 试验饲料组成及营养水平(干物质基础)

1)矿物质预混料为每千克饲料提供 Mineral premix provided the following per kg of diets：MgSO4·H2O 4 000 mg，MnSO4·H2O 50 mg，KCl (1%) 100 mg，CoCl2 (1%) 100 mg，CuSO4·5H2O 20 mg，FeSO4·H2O 260 mg，ZnSO4·H2O 150 mg，Na2SeO3 (1%) 50 mg。

试验饲料制作于集美大学水产试验场的饲料加工车间，各饲料原料使用超微粉碎机粉碎后过60目筛。再将原料按配比定量采用逐级扩大法混合均匀，加入30%左右的水拌匀，使用双螺旋杆饲料挤条机挤条，经饲料造粒机制作成2种不同粒径(1.0和2.5 mm)的硬颗粒饲料，将造粒后的饲料放置于电热鼓风干燥箱中45 ℃恒温干燥至水分含量为7%～9%，取出冷却后分装于密封袋中，置于-20 ℃冰箱中保存备用。

1.3 饲养管理

试验用花鲈鱼苗购自漳州一家苗种场，将鱼苗运至集美大学水产试验场后暂养于体积为1 000 L的养殖桶，使用商品饲料驯化14 d，驯化期间逐渐加入淡水，使花鲈适应淡水环境，养殖试验在淡水环境中进行。待鱼苗适应试验条件后，挑选225尾体格健壮、形态均一的花鲈，平均体重(9.0±0.5) g，随机分配到9个容积为200 L塑料桶，每缸25尾鱼。养殖试验持续8周。

每日定时饱食投喂2次(08:00、18:00)，记录每个试验缸的摄食量。试验期间记录死鱼数量并称重，适量换水。养殖条件为：12 h光照12 h黑暗，保持水温(27±1) ℃，溶解氧含量≥8.0 mg/L，氨氮含量<0.1 mg/L，pH 7.5～8.5。

1.4 样品收集

养殖试验结束后，停饲24 h，分别称量鱼体的重量，用于计算生长性能指标。每缸取12尾鱼麻醉(丁香酚1∶10 000)后用无菌的1 mL注射器进行尾静脉取血，取出的血液于4 ℃冰箱静置12 h，2 500 r/min离心10 min取上层血清，置于-80 ℃冰箱保存，用于测定血清相关指标。每缸取12尾鱼称量个体重和体长，解剖分离内脏团、肝脏、腹脂，分别称重，以计算形体指标。解剖分离12尾鱼的肝脏，其中9尾鱼的肝脏取出后迅速装入冻存管，用液氮速冻后转移至-80 ℃冰箱保存，用于肝脏相关指标测定。将每缸剩余的鱼体称重后保存在-20 ℃冰箱中，用作分析全鱼的体组成。

1.5 指标测定

1.5.1 生长性能、形体指标和营养物质表观消化率

生长性能、形体指标和营养物质表观消化率的相关计算公式如下：

增重率(weight gain rate, WGR, %)=[(Wt-W0)/W0]×100；特定生长率(specific growth rate, SGR, %/d)=[(lnWt-lnW0)/t]×100；饲料效率(feed efficiency, FE)=(Wt-W0)/Wf；摄食量(feeding intake, FI, g/尾)=(Wf/Nf)×100；腹脂率(abdominal fat rate, AFR, %)=(Wa/W)×100；肥满度(condition factor, CF, g/cm3)=(W/L3)×100；肝体比(hepatosomatic index, HSI, %)=(Wl/W)×100；脏体比(viscerosomatic index, VSI, %)=(Wg/W)×100；存活率(survival rate, SR, %)=(Nf/Ni)×100；某营养物质表观消化率(apparent digestibility coefficients, ADC, %)=[1-(饲料中三氧化二钇含量×粪便中该营养物质含量)/(粪便中三氧化二钇含量×饲料中该营养物质含量)]×100。

式中：W0为初始鱼总重量(g)；Wt为终末鱼总重量(g)；W为单尾鱼重量(g)；Wf为摄入的饲料总重量(g)；Wa为单尾鱼腹部脂肪重量(g)；Wl为单尾鱼肝脏重量(g)；Wg为单尾鱼内脏团重量(g)；t为饲喂天数；L为鱼体长(cm)；Ni为初始鱼数量；Nf为终末鱼数量。

1.5.2 体组成

全鱼的粗蛋白质含量采用凯氏定氮法(GB/T 5009.5—2003)测定，粗脂肪含量采用索氏抽提法(GB/T 5009.6—2003)测定，粗灰分含量采用马福炉灰化法(GB/T 5009.4—2003)测定，水分含量采用103 ℃恒温干燥失重法(GB/T 5009.3—2003)测定。

1.5.3 血清生化指标

血清甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、低密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、高密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)含量使用试剂盒测定，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，具体操作步骤按照说明书进行。

1.5.4 肝脏脂肪代谢相关指标

肝脏甘油三酯、总胆固醇含量使用试剂盒测定，试剂盒由南京建成生物工程研究所提供，具体操作步骤按照说明书进行。

1.5.5 肝脏RNA提取及实时荧光定量PCR(RT-qPCR)

肝脏组织样本总RNA的提取使用试剂盒(FastPure Cell/Tissue Total RNA Isolation Kit，南京诺唯赞生物科技股份有限公司)，具体操作步骤按照说明书进行。肝脏RNA逆转录使用试剂盒(TranScript All-in-One First-Strand cDNA Synthesis SuperMix for qPCR，北京迈瑞达科技有限公司)，具体操作步骤按照说明书进行。RT-qPCR使用试剂盒(PerfectStart Green qPCR SuperMix，北京迈瑞达科技有限公司)在Thermal Cycler Applied Biosystems QuantStudio 6&7实时荧光定量PCR仪(美国Bio-Rad公司)上进行操作，具体操作步骤按照说明书进行。使用β-肌动蛋白(β-actin)作为内参基因，采用2-ΔΔCt法计算各基因的mRNA相对表达量，花鲈肝脏脂肪代谢相关基因引物序列见表3。

表3 花鲈肝脏脂肪代谢相关基因引物序列

1.6 数据统计与分析

试验数据经Excel 2016归纳整理后，使用SPSS 21.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA)，用Tukey检验法进行多重比较，差异显著水平为P<0.05。试验数据均采用平均值±标准误表示。

2 结 果

2.1 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈生长性能、形体指标和体组成的影响

由表4可知，FM组的增重率、特定生长率和摄食量显著高于EPSI50组(P<0.05)。各组之间饲料效率、腹脂率、肥满度、肝体比、脏体比和存活率均无显著差异(P>0.05)。

表4 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈生长性能和形体指标的影响

由表5可知，各组之间全鱼的水分、粗蛋白质、粗脂肪、粗灰分含量均无显著差异(P>0.05)。

表5 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈体组成的影响(干物质基础)

2.2 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈营养物质表观消化率的影响

由表6可知，FM组的粗脂肪表观消化率显著高于EPSI50组(P<0.05)。各组之间干物质和粗蛋白质表观消化率均无显著差异(P>0.05)。

表6 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈营养物质表观消化率的影响

2.3 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈血清生化指标的影响

由表7可知，随着饲料中酶解大豆分离蛋白替代鱼粉比例的增加，血清甘油三酯、总胆固醇、高密度脂蛋白胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量呈降低趋势。ESPI25组和ESPI50组的血清总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇和高密度脂蛋白胆固醇含量显著低于FM组(P<0.05)，且ESPI50组的血清低密度脂蛋白胆固醇含量显著低于ESPI25组(P<0.05)。

表7 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈血清生化指标的影响

2.4 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈肝脏脂肪代谢的影响

2.4.1 各试验组花鲈肝脏油红染色

各试验组花鲈肝脏油红染色见图1，肝脏油红染色切片显示，FM组花鲈肝脏的脂肪沉积现象严重，红色脂滴密集且面积较大；用酶解大豆分离蛋白替代鱼粉后，ESPI25组和ESPI50组花鲈肝脏的红色脂滴面积减小，密度降低。

图1 各试验组花鲈肝脏油红染色

2.4.2 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈肝脏甘油三酯和总胆固醇含量的影响

由表8可知，ESPI50组的肝脏甘油三酯和总胆固醇含量显著低于FM组(P<0.05)，且ESPI50组的肝脏甘油三酯含量显著低于ESPI25组(P<0.05)。ESPI25组的肝脏总胆固醇含量显著低于FM组(P<0.05)。

表8 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈肝脏甘油三酯和总胆固醇含量的影响

2.4.3 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈肝脏脂肪代谢相关基因表达的影响

由图1、图2和图3可知，在脂肪合成相关基因方面，ESPI25组和ESPI50组的肝脏乙酰辅酶A羧化酶1(ACC1)、脂肪酸合成酶(FAS)、固醇调节原件结合蛋白-1c(SREBP-1c)、过氧化物酶体增殖物激活受体γ(PPARγ)、3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶(HMGCR)、碳水化合物反应元件结合蛋白(ChREBP)的mRNA相对表达量显著低于FM组(P<0.05)。在脂肪分解相关基因方面， ESPI25组和ESPI50组的肝脏腺苷酸激活蛋白激酶(AMPK)、过氧化物酶体增殖物激活受体α(PPARα)的mRNA相对表达量显著低于FM组(P<0.05)。在胆汁酸合成相关基因方面，各组之间肝脏胆固醇7α羟化酶(CYP7A1)和胆固醇12α羟化酶(CYP8B1)的mRNA相对表达量无显著差异(P>0.05)。

数据柱标相同小写字母表示差异不显著(P>0.05)，不同小写字母表示差异显著(P<0.05)。下图同。

图3 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈肝脏脂肪分解相关基因表达的影响

3 讨 论

3.1 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈生长性能的影响

酶解大豆分离蛋白具有降低其抗营养因子水平和富含多肽等优点被广泛关注，但当替代鱼粉的比例超过一定量时，同样也会对养殖动物的生长造成影响。本试验结果表明，当饲料中酶解大豆分离蛋白替代50%鱼粉时，花鲈的摄食量显著降低，与刘兴旺等[13]在大菱鲆、Wang等[14]在斜带石斑鱼的研究结果一致。鱼类通过对营养物质的消化吸收来促进机体生长，增重率和特定生长率是衡量生长情况的重要指标。Mamauag等[15]在饲料中用酶解大豆多肽替代鱼粉，研究其对牙鲆幼鱼生长情况的影响，当酶解大豆多肽替代鱼粉超过30%时，牙鲆幼鱼的增重率和特定生长率显著下降。在本试验中，饲料中酶解大豆分离蛋白替代25%和50%鱼粉时，花鲈的增重率和特定生长率均降低，且在酶解大豆分离蛋白替代50%鱼粉时显著降低。原因可能有以下2方面：1)过多的酶解大豆分离蛋白影响饲料的适口性，造成摄食量下降，鱼体摄入能量减少，无法满足生长所需；2)鱼类摄食过多的酶解大豆分离蛋白使鱼体肠道多肽和氨基酸的流入增加，导致积累速率不均匀，从而使氨基酸的代谢和蛋白质合成的速率不同，形成氮负平衡，降低了鱼体的生长。

图4 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈肝脏胆汁酸合成相关基因表达的影响

消化率是指被动物消化道吸收的营养物质占摄入食物总量的百分比，反映了鱼类对饲料中营养物质的吸收情况，是评价饲料营养价值的重要指标[16]。本试验结果发现，饲料中酶解大豆分离蛋白替代50%鱼粉时会显著降低粗脂肪表观消化率，这说明酶解大豆分离蛋白会影响鱼类对脂肪的消化吸收，减少机体对饲料脂肪的有效摄入，可能是影响体内脂肪代谢的一个原因。

3.2 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈血清生化指标的影响

研究发现，一些植物蛋白质有降低血清总胆固醇含量、影响胆固醇代谢的作用[17-18]，Aoyama等[19]研究发现，饲粮中添加大豆蛋白可以降低饮食性肥胖大鼠和遗传性肥胖小鼠的机体脂肪含量，促进机体脂肪代谢。在水产动物上，Kaushik等[20]用大豆蛋白替代虹鳟饲料中的鱼粉，发现虹鳟血清总胆固醇和低密度脂蛋白胆固醇含量显著降低。刘伟等[21]、冯建等[22]用大豆浓缩蛋白替代鱼粉，中华鲟和大黄鱼幼鱼血清总胆固醇和甘油三酯含量均随着大豆浓缩蛋白替代比例的升高而降低。本试验结果与上述试验结果类似，随着酶解大豆分离蛋白替代鱼粉比例的升高，花鲈血清甘油三脂、总胆固醇、低密度脂蛋白胆固醇含量均显著下降。这可能是因为酶解大豆分离蛋白提高了花鲈脂质代谢的能力，使血脂降低，这在肝脏脂肪代谢中也得到了印证。

3.3 酶解大豆分离蛋白替代鱼粉对花鲈肝脏脂肪代谢的影响

肝脏是鱼类脂肪代谢的主要器官，而肝脏脂肪的异常沉积易导致鱼类一系列的生理功能障碍。在本试验中，肝脏油红切片可以直观显示FM组肝脏脂肪含量明显高于ESPI25组和ESPI50组。对肝脏甘油三酯和总胆固醇含量的测定也说明，二者随着饲料中酶解大豆分离蛋白替代鱼粉比例的升高而降低，表明酶解大豆分离蛋白可缓解肝脏中脂肪的异常沉积。在此过程中许多关键的脂肪代谢调控因子和通路也可能发挥重要的作用。SREBP-1c是维持细胞内脂肪稳定的重要核转录因子，SREBP-1c/FAS和SREBP-1c/HMGCR通路可调控甘油三酯和胆固醇的合成[23]。ChREBP在ACC1和FAS的糖脂代谢调节中起主要作用。ChREBPmRNA相对表达量的下降说明糖酵解转化脂肪的途径受到抑制。PPARγ是一种参与脂质代谢的核受体，是代谢组织中的营养传感器[24]。本试验发现，饲料中酶解大豆分离蛋白替代25%和50%鱼粉显著降低了肝脏中ACC1、FAS、SREBP-1c、PPARγ、HMGCR和ChREBP的mRNA相对表达量，说明酶解大豆分离蛋白可能抑制肝脏脂肪合成相关基因表达，从而减少肝脏的脂肪合成。

PPARα调节脂肪酸β氧化[25]，可以通过促进肉毒碱棕榈酰转移酶1(CPT1)的表达来调控脂肪酸向线粒体的转运[26-27]，增强脂肪酸的氧化效率。本试验中，FM组的肝脏PPARα的mRNA相对表达量显著高于ESPI25组和ESPI50组，说明FM组肝脏中脂肪酸β氧化高于ESPI25组和ESPI50组。在大菱鲆上的研究发现，高脂饲料可以通过上调肝脏中PPARα的表达促进脂肪的分解代谢[28]。在多鳞白甲鱼的研究中发现，高脂饲料导致的肝脏脂肪沉积增加，会上调肝脏中PPARα、CPT1和脂肪甘油三酯脂肪酶(ATGL)的基因表达[29]。AMPK在真核细胞中普遍表达，是能量状态的传感器。当细胞的能量状态受到损害时，AMPK活化并激活分解代谢途径，提高腺苷一磷酸(AMP)/ATP的比值并抑制ATP的消耗来维持细胞的能量稳态[30-31]。AMPK还可以直接激活ATGL和激素敏感性脂肪酶(HSL)[32-33]。ATGL和HSL是2个参与脂肪分解的限速酶，ATGL可以特异性水解甘油三酯为甘油二酯，HSL参与了甘油三酯分解为甘油二酯再到甘油一酯的整个过程[34]。本试验发现，FM组的肝脏AMPK、ATGL和HSL的mRNA相对表达量高于ESPI25组和ESPI50组，说明FM组肝脏脂肪分解比较旺盛。有研究指出，肝脏中脂肪沉积的增加会提升脂肪分解的速率[35]。艾庆辉等[36]研究发现，饲料脂肪水平升高会显著促进半滑舌鳎内脏团HSL基因的表达；Han等[37]在罗非鱼上的研究也得到类似结果，肝脏和肌肉中HSL的mRNA相对表达量随着饲料脂肪水平的升高而升高。本试验中，FM组肝脏脂肪分解相关基因的mRNA相对表达量高于ESPI25组和ESPI50组，原因可能是FM组花鲈对外源脂肪的吸收较多，内源脂肪的合成也高于ESPI25组和ESPI50组，为促进肝脏的脂肪代谢，脂肪分解相关基因上调，加快脂肪分解的速率，维持肝脏稳态。

4 结 论

高比例酶解大豆分离蛋白替代鱼粉会导致花鲈的摄食量降低，从而抑制其生长性能。但饲料中酶解大豆分离蛋白替代鱼粉可以通过降低血清和肝脏甘油三酯和总胆固醇含量，抑制脂肪合成基因的表达，从而减少花鲈机体脂肪的沉积。