冯楠楠，李青青，沐 琦，林珊愉，刘圣权，李浩君，李春远，熊亚红

(1 华南农业大学 生物基材料与能源教育部重点实验室/材料与能源学院, 广东 广州510642；2 广东新科农生物科技有限公司, 广东 韶关 512000)

近年来，全球气候变暖和农业产业结构的变化导致植物病害频繁暴发，对我国农业生产造成严重威胁[1]，例如禾谷镰孢菌Fusarium graminearum可引起小麦赤霉病，多在小麦穗期和苗期发生，导致苗腐、杆腐和穗腐[2]，尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum可引起番茄枯萎病，侵染植株导管组织，使得植株萎蔫[3]。化学防治由于见效快一度成为我国病害防治的重要手段，但用量大、毒性强、残留多等问题也给环境造成了严重威胁[4]。植物内生真菌次级代谢产物属于天然产物，通常毒性低、易降解，是发掘新的环境友好的抗菌活性物质的重要资源[5]，红树林真菌代谢产物是其中的研究热点[6]。高粱附球菌Epicoccum sorghinumL28是我们分离自海洋红树林植物苦槛蓝Myoporum bontioidesA. Gray叶片的1株内生真菌，前期曾从中发现了9个具有抗菌活性的新化合物[7]。本文研究其代谢产物的分离、鉴定及抗植物病原菌活性，以期找到有潜力的防治植物病害的活性物质。

1 材料与方法

1.1 材料

LCMS-IT-TOF 液质联用仪，日本Shimadzu公司生产；Bruker AV600核磁共振波谱仪，德国Bruker Biospin GmbH 公司生产。硅胶柱填料(50 ～80 μm)，中国青岛海洋化工有限公司生产；其余所有分离溶剂均为分析级。三唑酮，中国上海Aladdin生化科技有限公司生产。

高粱附球菌Epicoccum sorghinumL28于2018年6月从中国雷州半岛半红树林植物苦槛蓝Myoporum bontioides叶片中分离得到。其种属已通过形态学、内部转录间隔区(ITS)rDNA序列(Genbank No. MZ378789) 和β-微管蛋白 (βtub2)基因序列(Genbank No. MZ407981)得到鉴定并报道[7]。它与禾谷镰孢菌Fusarium graminearum、尖孢镰孢菌Fusarium oxysporum保藏在华南农业大学材料与能源学院。

1.2 发酵培养

将E. sorghinumL28菌株接种于马铃薯蔗糖琼脂(PSA)培养基，28 ℃恒温黑暗条件下培养5～7 d活化。在1 000 mL锥形瓶中装入100 g 籼米，100 mL水，于121 ℃ 高温高压灭菌30 min后接种活化后的E. sorghinumL28菌株，28 ℃条件下静置培养30 d，共培养100瓶。

1.3 发酵产物的分离与提取

用φ为95%乙醇溶液浸泡菌种，重复3次，每次浸泡3 d。将乙醇提取液浓缩，用乙酸乙酯萃取3次，浓缩后经硅胶柱层析法分离代谢物，按照石油醚∶乙酸乙酯体积比 10∶0～0∶10、乙酸乙酯∶甲醇体积比10∶0～5∶1梯度洗脱，再借助硅胶柱色谱进行分离，得到化合物1～10。

1.4 结构鉴定

通过分析化合物的氢谱(1H NMR)、碳谱(13C NMR)、电喷雾质谱(ESIMS)、电喷雾高分辨质谱(HRESIMS)等试验数据，并与文献或标准品对照，鉴定化合物1～10的结构。

1.5 抗菌活性测试

采用二倍稀释法[8]测试化合物对小麦赤霉菌F. graminearum和番茄枯萎菌F. oxysporum的最小抑菌浓度(Minimum inhibitory concentration，MIC)阳性对照选取三唑酮。

2 结果与分析

2.1 化合物及波谱数据

分离到10种化合物，在V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) =3∶1时得到化合物1 (1.7 mg)和化合物2(1.8 mg)；在V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) =1∶1 时用乙酸乙酯重结晶，而后用甲醇清洗晶体表面得到化合物3(30.5 mg)；在V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) =1∶1 时得到化合物 4 (20.9 mg)；在V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) =7∶1时得到化合物 5 (1.7 mg)；在V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) =1∶3时分离得到化合物6和化合物7的混合物(79.5 mg)；在V(石油醚)∶V(乙酸乙酯) =10∶1时分离得到化合物8(14.7 mg)；在V(乙酸乙酯)∶V(甲醇)=10∶1 时分离得到化合物 9(3.8 mg)和化合物10(8.5 mg)。

鉴定化合物1～10分别为7-羟基-2，5-二甲基色原酮、Livistone A、Barceloneic acid A、Barceloneic lactone、2′-O-methylbarceloneate、Spirostaphylotrichin R、 Spirostaphylotrichin U、β-谷甾醇、β-胡萝卜苷和β-腺苷。其中化合物1～7的波谱数据如下。

化合物1：黄色晶体。分子式C11H10O3，ESIMS(m/z)：191.1 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，acetone-d6)δH2.29 (d, 0.50 Hz, 3H), 2.70 (s, 3H), 5.94 (s, 1H),6.67 (d, 2.0 Hz, 1H), 6.68 (d, 2.0 Hz, 1H)。13C NMR(100 MHz, acetone-d6)δC179.5, 164.6, 161.8, 160.6,143.0, 117.2, 113.1,111.7, 101.5, 22.8, 19.7。

化合物2：无色粉末。分子式为C16H14O6，ESIMS (m/z)：335.1 [M+H]+。1H NMR (400 MHz,acetone-d6)δH6.66 (br s, 1H), 6.52 (br s, 2H), 5.06 (s,2H), 2.44 (s, 3H), 2.36 (s, 3H);13C NMR (150 MHz,acetone-d6)δC163.9, 162.2, 161.4, 155.6, 146.0,144.9, 143.5, 132.6, 116.7, 116.5, 115.0, 113.9, 106.0,56.4, 21.3, 17.2。

化合物3：乳白色粉末。分子式C16H16O7，ESIMS (m/z)：320.1 [M+H]+。1H NMR (400 MHz,acetone-d6)δH6.67 (d, 3.0 Hz, 1H), 6.54(d, 3.0 Hz,1H), 6.49 (d, 1.8 Hz, 1H), 6.02 (d, 1.8 Hz, 1H), 4.53(br s, 2H), 3.80 (s, 3H), 2.18 (s, 3H);13C NMR (150 MHz, acetone-d6)δC171.9, 164.4, 159.3, 159.2,151.07, 147.8, 137.5, 132.5, 112.6, 105.7, 105.3,102.5, 101.0, 60.3, 55.8, 22.0。

化合物4：无色结晶。分子式为C16H14O6，ESIMS (m/z)：303.1 [M+H]+。1H NMR (400 MHz,acetone-d6)δH8.95 (s, 1H), 8.55 (s, 1H), 6.74 (d, 3.0 Hz, 1H), 6.56 (d, 3.0 Hz, 1H), 6.55 (d, 3.0 Hz, 1H),6.28 (d, 3.0 Hz, 1H), 5.17 (br s, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.27(s, 3H);13C NMR (150 MHz, acetone-d6)δC167.8,156.9, 156.3, 153.9, 150.1, 145.0, 138.7, 128.9, 114.9,114.6, 111.9, 105.4, 103.3, 69.2, 55.5, 21.2。

化合物5：白色粉末。分子式C17H18O7，ESIMS(m/z)：335.1 [M+H]+。1H NMR (400 MHz, acetoned6)δH11.02 (s, 1H), 8.30 (s, 1H), 6.70 (d, 3.0 Hz,1H), 6.49 (d, 3.0 Hz, 1H), 6.42 (s, 1H), 5.95 (s, 1H),4.49 (d, 4.0 Hz, 2H), 4.07 (t, 5.6 Hz, 1H), 3.94 (s, 3H),3.79 (s, 3H), 2.14 (s, 3H);13C NMR (150 MHz,acetone-d6)δC170.7, 162.2, 159.2, 158.0, 150.0,145.9, 137.0, 132.2, 110.6, 105.4, 103.9, 102.1, 101.0,58.8, 54.7, 51.8, 21.6。

化合物6 (和化合物7以物质的量3∶5混合)：淡黄色固体。分子式C14H19NO6，HRESIMS (m/z)：298.129 5 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH7.05 (d, 10.0 Hz, 1H), 6.17 (t, 12.0 Hz, 1H), 5.93, (d,10.0 Hz, 1H), 4.74, (s, 1H), 4.09 (s, 1H), 4.01, (s, 3H),2.21 (m, 2H), 1.67 (s, 3H), 1.05 (t, 7.2 Hz, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)δC197.1, 167.5, 153.2,150.5, 128.5, 120.9, 86.7, 73.5, 68.5, 64.5, 56.5, 23.6,23.5, 13.5。

化合物7 (和化合物6以物质的量5∶3混合)：淡黄色固体。分子式C14H19NO6，HRESIMS (m/z)：298.129 3 [M+H]+。1H NMR(400 MHz，CDCl3)δH7.12 (d, 10.0 Hz, 1H), 6.37 (t, 12.0 Hz, 1H), 5.97 (d,10.0 Hz, 1H), 4.74 (s, 1H), 3.83 (s, 1H), 4.01 (s, 3H),2.27 (m, 1H), 2.10 (m, 1H), 1.55 (s, 3H), 1.08 (t, 7.2 Hz, 3H)。13C NMR (100 MHz, CDCl3)δC195.3,166.3, 154.0, 152.6, 127.3, 120.1, 90.4, 73.3, 73.2,64.5, 56.8, 23.6, 18.6, 13.2。

化合物8、化合物9和化合物10为β-谷甾醇、β-胡萝卜苷、β-腺苷，均为真菌和天然产物中常见的化合物，数据略。

2.2 化合物结构鉴定

所鉴定的10个化合物的结构如图1所示。

图1 化合物的分子结构Fig. 1 Structures of compounds

化合物1的1H NMR谱δH6.67 (d, 2.0 Hz),6.68 (d, 2.0 Hz)苯环间位H信号表明存在1个1，2，3，5-四取代苯环，13C NMR谱除显示6个苯环碳信号外，还显示1个双键及1个与苯环及双键共轭的羰基碳信号δC179.5，这表明化合物1具有色原酮碳架。此外，1H NMR谱还观察到2个甲基信号δH2.29、 2.70及1个未与其他质子偶合的双键H信号δH5.94。查阅文献核磁数据[9]，鉴定为7-羟基-2，5-二甲基色原酮。

化合物2的1H NMR谱显示了3个苯环H信号(由于仪器分辨率问题，未能观察到明显裂分)，结合13C NMR谱12个双键碳及1个羰基碳信号，表明分子仍是二苯醚骨架，且与化合物3相比多1个环结构，推测可能具有内酯环结构。1H NMR谱还显示了1个连羟基的—CH2以及2个甲基信号。查阅文献波谱数据[10]，鉴定为Livistone A。

化合物3的分子式通过ESIMS (m/z)：320.1[M+H]+结合13C NMR确定分子式为C16H16O7。1H NMR 谱δH6.67 (d, 3.0 Hz, 1H), 6.54 (d, 3.0 Hz, 1H),6.49 (d, 1.8 Hz, 1H), 6.02 (d, 1.8 Hz, 1H) 的信号表明存在 2 个 1，2，3，5-四取代苯环；δH4.53 (br s,2H)是连羟基的亚甲基信号, 3.80 (s, 3H)和2.18 (s,3H)分别是甲氧基和甲基信号，13C NMR谱除上述基团外，还显示了1个羧基碳信号δC171.9，剩余的取代基为满足分子式推测可能是羟基。根据文献[11]，鉴定为Barceloneic acid A。

化合物 4的1H NMR 谱δH6.74 (d, 3.0 Hz, 1H),6.56 (d, 3.0 Hz, 1H), 6.55 (d, 3.0 Hz, 1H), 6.28 (d, 3.0 Hz, 1H)表明，其和化合物3一样存在2个1，2，3，5-四取代苯环，δH5.17 (br s, 2H), 3.72 (s, 3H), 2.27(s, 3H)分别是1个连氧的亚甲基，1个甲氧基和1个甲基信号，δH8.95 (s, 1H), 8.55 (s, 1H)是2个酚羟基信号，表明化合物4仍然是二苯醚骨架。13C NMR谱还显示了1个酯羰基信号，根据文献[12]数据，鉴定为Barceloneic lactone。

化合物5的相对分子质量比化合物3的多15，1H NMR及13C NMR与化合物3的十分类似，仅多出了 1 个甲氧基信号δH3.94 (s, 3H)，δC58.8，由于苯环碳化学位移值基本未变化，推测化合物5是化合物3羧基H被甲基取代的衍生物。根据文献[13]数据，鉴定为 2′-O-methylbarceloneate。

化合物6和化合物7一起被分离到，通过氢谱积分比例发现二者大约以物质的量3∶5的比例混合，碳谱显示出28个碳，且每2个碳的化学位移值比较接近，推测这2个化合物是1对旋光异构体。化合物6和7的HRESIMS (m/z)：298.129 5 [M+H]+结合13C NMR谱(共显示28个C，按每个化合物14个C计)表明每个化合物的分子式为C14H19NO6。通过1H-1H COSY以及氢谱积分，可以发现1H NMR 谱δH7.05 (d, 10.0 Hz, 1H)，5.93 (d, 10.0 Hz,1H) 是1对双键上的H，结合异核单量子关系(Heteronuclear singular quantum correlation,HSQC)的13C NMRδC153.2, 120.9 的碳，再联系197左右的碳，推测分子中存在1 个α，β-六元环的烯酮结构单元。1H NMR谱δH6.17 (t, 12.0 Hz, 12-H) 的双键化学位移偏向低场，同时观察到它和δH7.05弱的1H-1H COSY相关信号，再根据偶合常数和氢谱积分可以判断其一端与前述烯酮的双键相连且形成共轭，1H-1H COSY相关信号和积分比例显示，其另一端与δH2.21 (m, 2H)的—CH2相连，该—CH2则与δH1.05 (t, 7.2 Hz, 3H)的甲基连接。此外，根据积分比例还可以判断出1H NMR 谱中化合物6和7的混合物每个异构体分子分别具有2个连氧的次甲基、1个甲氧基和1个甲基。扣除每个分子中的双键和羰基(δC120.0 ～197.1)所具有的不饱和度，表明分子中存在双环结构，结合分子式判断可能还有1个五元环，查阅文献[14]，鉴定二者为Spirostaphylotrichin R和Spirostaphylotrichin U的混合物，且物质的量比为3∶5，并进行了氢谱和碳谱的归属。

化合物8、化合物9和化合物10为真菌和植物中常见代谢产物，化合物8的波谱数据与文献[15-16]对比基本一致，化合物9和10波谱数据与文献[17-18]基本一致，分别鉴定为β-谷甾醇、β-胡萝卜苷和β-腺苷。

2.3 抗植物病原菌活性测定

采用二倍稀释法测定化合物1～10对小麦赤霉菌和番茄枯萎菌的MIC，结果表明，化合物1对小麦赤霉菌的MIC为100 μg/mL，强于阳性对照三唑酮的150 μg/mL，同时其对番茄枯萎菌的MIC也为100 μg/mL，与阳性对照等效。化合物5对番茄枯萎菌的MIC为200 μg/mL，效果弱于三唑酮的100 μg/mL。在抗菌测试所测样品最高质量浓度为200 μg/mL的情况下，其余化合物仍有菌生长，即MIC数据均大于200 μg/mL。

3 结论与讨论

从高粱附球菌Epicoccum sorghinumL28的发酵物乙醇浸泡液中共分离得到10种化合物。我们曾从该菌分离到9个二苯醚类新化合物，它们的结构与本研究所得化合物均不相同[7]。本研究所得化合物除化合物2～5属于二苯醚结构类型外，还包括色原酮、生物碱、甾醇结构类型，丰富了该菌的代谢产物库，证实了该菌代谢产物具有结构多样性。抗菌测试结果表明，化合物7-羟基-2，5-二甲基色原酮(化合物1)能强烈抑制禾谷镰孢菌和尖孢镰孢菌的生长，2′-O-methylbarceloneate (化合物 5)对尖孢镰孢菌的生长具有中等抑制作用，可作为相应的抗菌先导化合物开展深入研究。据文献报道Livistone A具有较强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，IC50为2.1 ±0.2 μmol/L[19]，且其对 H2O2诱导的 SH-SY5Y(人神经母细胞瘤细胞)细胞损伤具有明显的细胞保护活性[10]；Barceloneic acid A是一种新型温和的法呢基转移酶(Farnesyl protein transferase, FPTase)抑制剂，IC50为 40 μmol/L[11]；Spirostaphylotrichin R 具有抗氧化活性，对OH-的抑制作用较强，IC50为0.17 mmol/L，对1，1-二苯基-2-三硝基苯肼自由基(DPPH自由基；1, 1-diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)和O2-自由基的清除作用较弱，IC50分别为0.50和5.15 mmol/L[20]。因此，它们也具有相应的开发价值。本研究结果丰富了天然植物内生真菌抗植物病原菌化合物库，有利于抗菌农药的开发。此外，研究也为Livistone A、Barceloneic acid A、Spirostaphylotrichin R等活性物质提供了新的菌种来源，有助于后续开展深入研究。