李 欣 胡 巍 谭宏凯 黎晶晶 陈红兵

(1.南昌大学 食品科学与技术国家重点实验室, 江西 南昌 330047；2.南昌大学 食品学院, 江西 南昌 330047；3.江西省食物过敏重点实验室, 江西 南昌 330047；4.南昌大学 中德联合研究院,江西 南昌 330047)

食物过敏(food allergy,FA)被定义为机体暴露于某些食物过敏原所产生的免疫不良反应[1],通常表现为皮肤、呼吸道、消化道等组织器官相关的临床症状,严重时可威胁生命安全[2]。 据流行病学调查研究,食物过敏的发生率呈现出逐年上升的趋势[3],其中婴幼儿的过敏发生率比成年人高。 如2006年至2016年美国的婴幼儿食物过敏患病率从1.8%升高至7.6%[4-5],英国的婴幼儿患病率由2006年的4.0%升高至2016年的7.1%[6-7],我国小范围调查则表明,2009年至2019年0～2岁婴幼儿患病率由7.7%升高至11.1%[8]。 早在1985年联合国粮农组织和世界卫生组织(FAO/WHO)食品法典委员会即提出“八大类”过敏食物,分别是鸡蛋、牛奶、花生、大豆、鱼、海鲜、小麦和坚果[9]。 2020年,基于食物过敏发病率、严重程度、致敏能力数据的风险评估,FAO/WHO 食物过敏风险评估专家组推荐全球优先标示的过敏食物为牛乳、鸡蛋、花生、特定的坚果(杏仁,腰果,榛子,美国碧根果,开心果和核桃)、鱼、芝麻、含面筋蛋白的谷物以及甲壳类水产品[10]。 尽管医学界尚在不断寻找有效的治疗手段,但迄今为止,避免过敏食物仍然是防治食物过敏最有效的方法。 然而,在食品加工多元化的背景下,FA 患者要完全避免过敏原十分困难。 因此,研发并生产低致敏食品对FA 患者的健康而言至关重要。

1 低致敏食品制备技术分类及作用机制

1.1 热加工对食物过敏原致敏性的影响

目前已广泛研究由热处理引起的食物过敏原致敏性变化,热处理可以分为湿热处理(煮、蒸、油炸)和干热处理(焙烤、微波)。 加热可以诱导蛋白质变性,致敏性构象表位被破坏,重新排列或形成新的分子内或分子间键,导致表位不再被IgE 抗体所识别或触发免疫反应,从而降低食物过敏原的致敏性[11-16]。 与生鸡蛋相比,煮、蒸、焙烤、煎炸均能降低鸡蛋的致敏性,其中烘烤和煎炸方法最为有效,这是由于加工后可溶性过敏原如卵转铁蛋白、卵白蛋白和卵粘蛋白的含量下降,同时加工处理后的鸡蛋过敏原致敏动物后,其Jagged2-Notch 信号通路介导的Th2 免疫应答反应下调[13]。 然而,在一些情况下,加热也可能导致食物过敏原的致敏性升高,可能是由于构象变化致使隐藏的氨基酸被暴露或新的过敏原表位产生；也可能是由于食物过敏原对变性具有抵抗力,在加热条件下仍保持诱发免疫反应的能力。 Faisal 等[15]发现温度和水的存在似乎是控制食物过敏原致敏性的重要因素,在油炸或煮沸过程中升高温度会使虾原肌球蛋白的抗原性增加,可能是由于结构展开致使原肌球蛋白的隐藏表位被进一步暴露。

1.2 非热加工对食物过敏原致敏性的影响

大量研究已证实非热加工会对蛋白质进行结构修饰并影响其致敏性,本质上是蛋白质致敏性构象表位在蛋白质发生结构修饰过程中可能被打断、掩蔽或愈加暴露,表位的呈现情况与过敏原的IgE 结合能力紧密相关,影响着过敏原的致敏性[17]。 目前消减食物致敏性的非热加工技术主要包括高压、脉冲电场、脉冲光、低温等离子体、辐照和超声等。

高压加工引起过敏原蛋白的变性、展开和聚集,从而改变构象表位及其IgE 结合能力,可以有效地降低食物免疫反应性[18]。 如Yao 等[19]的研究结果表明高压加工处理致使过敏原蛋白趋于聚集,面筋分子之间的疏水相互作用增强且二硫键含量升高,有助于降低小麦的致敏性,在400 MPa 20 min 的处理条件下小麦的致敏性降低了72.2%。

脉冲电场因具有降低食物致敏性的作用潜力,近年来逐渐被广泛应用于蛋白质的结构修饰。 如涂宗财等[20]研究了25 kV/cm 强度的脉冲电场对牛乳β-乳球蛋白免疫反应性的影响,在处理时间为210 μs 时过敏原的致敏性下降58%。 Yang 等[21]发现随着电场强度和处理时间的提升,蛋制品的致敏性先升高后降低。 可能是因为在低场强条件下鸡蛋过敏原结构部分展开从而致使表位更加暴露。

在低致敏食品开发研究领域,脉冲光技术多以脉冲紫外光的形式出现。 由于含有大量的发色基团,蛋白质易于发生光反应。 在吸收光后蛋白质侧链氧化,进而发生交联、聚集或者发生结构修饰和多肽链断裂,致敏表位随之减少[22-23]。 如Yang 等[24]设置了2 ～6 min 的脉冲紫外光处理,结果表明大豆过敏原随着处理时间的增加而减少并且IgE 结合能力在4 min 时降低了44%。

低温等离子体可能通过注入活性氧自由基促进液体中的反应或促进不溶性蛋白质聚集体的产生,从而改变表位结构[25]。 如Ng 等[26]比较了火花放电和辉光放电两种方式的大气低温等离子体技术在牛乳脱敏中的作用,SDS-PAGE 和LC-MS/MS 鉴定结果显示α-乳白蛋白含量减少,ELISA 定量结果表明α-乳白蛋白和酪蛋白的致敏性显著降低。

随着近年来非热加工技术的发展,辐照技术在食物过敏中的应用日益增多。 辐照后的过敏原蛋白会发生一定程度的交联和聚集,这种现象是由光子直接或活性氧间接破坏过敏原结构中的共价键所引起。 如罗春萍等[27]研究发现剂量超过10 kGy 的60Co-γ可以降低花生的致敏性,Ara h 2 免疫印迹条带几乎消失且IgG 结合能力均低于10%。 辐照消减致敏性的另一种可能机制是辐射后水分子会产生大量羟基自由基,它们通过与氨基酸中的自由基反应引发过敏原表位肽的交联或断裂[28]。

超声在介质中传播时会产生热效应、机械效应或空化效应,过敏原物质能吸收超声波的能量并将其转换成热能,而这种热能可将过敏原物质降解[29]。 如Wang 等[30]利用20 kHz 400 W 的高强度超声处理16 min,成功地将猕猴桃过敏原的含量降低了50%,并指出致敏性的降低是因为超声显著破坏了猕猴桃组织的微观结构和蛋白质二级结构。

热加工与非热加工技术对不同种类食物过敏原致敏性的代表性影响见表1[11-16,19-21,24,26-27,30-43]。

表1 不同加工技术对食物过敏原致敏性的影响Tab.1 Effects of different process technology on allergenicity of food allergens

1.3 其他加工方法对食物过敏原致敏性的影响

除热加工与非热加工外,酶水解、酶交联、糖基化、微生物发酵等方法通过改变蛋白质构象或将蛋白质与糖类物质结合,破坏或隐藏过敏原表位,使得食物过敏原致敏性有效降低[44-46]。 另外,通过现代育种技术也可以达到消减甚至消除食品原料致敏性目的。 如Nishio 等[47]通过γ 射线诱导,获得了过敏原蛋白含量降低的4 种水稻突变体。 运用基因改良、基因移除和基因沉默技术也可以降低食物蛋白质的过敏性,如Kalunke 等[48]利用RNAi 沉默获得3个小麦转基因品系,并证明这3 个转基因品系与IgE 的结合能力都显著降低。

2 低致敏蛋白配料的工业化生产

最早于20 世纪40年代,人们开始生产基于水解牛奶蛋白的配方粉,水解乳蛋白是通过化学或酶水解降低牛奶蛋白的分子量和肽链长度,减低或消除牛奶蛋白的免疫原性,继而减少发生牛奶蛋白过敏的风险[49-50]。 根据蛋白水解物和产品类型的不同,其工艺流程也略有不同,一般工业化的水解乳蛋白的制备主要有3 种方法[51]。 1)直接酶解法。 将选定的酶直接添加到蛋白溶液中,在酶活性的最佳条件下进行水解,直到达到所需的水解程度。 2)膜生物反应器。 可用于连续水解并过滤出一定分子量的目的水解产物。 3)固定化酶解法。 将蛋白酶通过共价键结合在固体基质或膜上,并用于制备蛋白水解物。 另外,根据蛋白水解的程度可将水解蛋白分为部分水解蛋白和深度水解蛋白[52]。

2.1 部分水解乳蛋白的制备

牛乳中的乳清蛋白为适度水解配方乳的主要原料,部分水解配方中肽段分子质量主要集中在3 ～10 kDa[53]。 欧盟标准EU2016/127 第21 条规定,蛋白质水解物制成的配方奶粉中蛋白质含量不得低于1.86 g/100 kcal(4.44 ×104g/J),同时对水解乳蛋白的所用蛋白质原料进行规定:应使用凝乳酶沉淀酪蛋白后提取的脱盐甜乳清蛋白。 该脱盐甜乳清蛋白包含以下成分:w=63%的乳清蛋白分离物(不含酪蛋白糖肽、蛋白质含量高于干物质质量分数的95%、灰分不大于3%)和w=37%的甜乳清蛋白浓缩物(蛋白质大于干物质质量分数的87%、灰分不大于3.5%),同时要求其中变性的蛋白质质量分数小于70%。

2.2 深度水解乳蛋白的制备

目前,在深度水解蛋白配方乳粉所包含的肽中,95%以上分子质量低于3 kDa[54]。 主要以乳清蛋白为原料的深度水解蛋白已经商业化。 深度水解乳蛋白制备的第一步是在选定的牛奶蛋白中添加肽酶。肽酶可以分为内肽酶和外肽酶两种,通常会将两种酶混合使用。 内肽酶在蛋白质内的特定氨基酸上破坏蛋白质,而外肽酶则从蛋白质肽链末端位置切割蛋白质。 目前常用的酶包括胃蛋白酶和胰蛋白酶为代表的动物源水解酶以及木瓜蛋白酶和菠萝蛋白酶为代表的植物源水解酶[51]。 酶解后需要对酶进行灭活,防止进一步发生不受控制的水解,影响产品味感,而且灭活酶也是避免婴儿摄入后产生不良反应的安全措施的一部分,该过程需要严格验证。

2.3 其他低致敏食物的制备

由于乳清蛋白在牛奶中含量相对较低,价格昂贵,酪蛋白水解物可被用于部分替代乳清蛋白,使用不同的酶解条件可以制备深度水解或适度水解酪蛋白[55-56]。 近年来人们开始探索采用其他哺乳动物来源的蛋白质来替代牛奶蛋白,如山羊奶、骆驼奶和马奶。 然而,由于氨基酸序列与牛奶蛋白存在一定的同源性,免疫交叉反应可导致牛乳过敏患者对这些动物奶无法耐受。 从牛乳过敏管理的角度而言,目前尚缺乏对其他动物来源婴配奶粉科学的致敏性安全评价研究[57]。 此外,由于大米的低致敏性以及牛奶蛋白和大米蛋白之间不存在免疫交叉反应,水解大米蛋白配方适用于牛乳蛋白过敏儿童的饮食[58]。 大豆蛋白是优质的食物蛋白,以大豆蛋白为原料进行水解,制备低致敏水解大豆蛋白配料也值得关注。 基于大豆和水解大米的婴儿配方奶粉耐受性良好,在一些国家被认为是牛乳过敏婴幼儿的第二选择,但已有报道证据表明,植物蛋白配方奶粉不一定能满足婴幼儿的营养需求[59],值得关注。

3 结论

目前有关低致敏食品制备技术原理的研究大多还停留在全蛋白水平,未来应更多关注针对过敏原表位的致敏性消减技术。 同时,目前低致敏产品的质量评估未形成统一且完整的技术体系,且致敏性和营养吸收效果仅以分子质量作为评判依据,由此可见其检测指标也有待更进一步完善。 更重要的是,应进行动物和临床试验进一步评价低致敏食品的安全性。 对于低致敏食品的研发而言,希望本文可为工业化生产低致敏食品提供最新参考信息。