罗黎明，李龙雪，舒 坤，肖素云，吴钟睿，洪 滔，刘志勇

(江西中医药大学实验动物科技中心，330004，南昌)

0 引言

一些对水代谢或血液循环有益的中药通常具有利尿作用，同时加工技术的不同会使这些中药可能具有不同靶点甚至多靶点的利尿作用[1]，由于传统利尿西药有一定的副作用，因此，寻找具有利尿作用的中草药成为越来越受欢迎的研究方向[2-4]。薏苡仁是国内非常受欢迎的药食两用物质，它具有良好的除湿作用，用作治疗湿证相关疾病的药物，法薏仁是根据中药炮制理论，将薏苡仁经浸、蒸、炒等多种炮制方法组合加工而成的薏苡仁的炮制品，它的药性由凉转平，对健脾利湿有很好的保健作用[5-6]。 薏苡仁及其粗提物的药理特性以前已有研究，然而，在正常条件下，薏苡仁，尤其是法薏仁的利尿活性和利尿机制，尚未在正常大鼠中进行系统研究。因此，迫切需要弄清两者的利尿活性和利尿机制的区别，以期为临床用药提供指导。本研究的目的是评估薏苡仁及其新炮制品法薏仁在7 d内对正常大鼠的利尿活性，通过给药后不同时间点(1 h、2 h、3 h、4 h、6 h、24 h、48 h、72 h、96 h、110 h、134 h和158 h)测量尿量、尿电解质浓度(Na+、K+、Ca2+、Cl-)和pH值，检测尿中Na+-K+ATPase、心房肽素(ANP)、抗利尿激素(ADH)、醛固酮(ALD)以及AQPs水平。

1 材料

1.1 仪器

大鼠代谢笼(山东新华实验动物设备有限公司)；全波长酶标仪(美国Thermo公司)；PH S-3C型精密pH计(上海雷磁仪器厂)；尿液离子检测Beckman couler AU2700(美国)。

1.2 药品与试剂

生薏苡仁粉，法薏仁粉，均由江西景德中药有限公司提供；呋塞米片(上海朝晖制药公司，批号：20191021)；戊巴比妥钠(德国默克公司，批号：K2208)；大鼠ADH抗利尿激素酶联免疫吸附(ELISA)试剂盒(批号：20190513)、大鼠ALD醛固酮试剂盒(批号：20191027)、大鼠ANP心房钠尿肽ELISA试剂盒(批号：20190922)均购自上海赫澎生物科技有限公司。

1.3 受试动物

雄性无特定病原体级SD大鼠，体重范围为180～220 g，由江西中医药大学实验动物科技中心提供，生产许可证号：SCXK(赣)2018―0003。在江西中医药大学屏障实验系统内组织实施，系统使用许可为SYXK(赣)2017―0004。所有动物操作符合实验动物伦理要求,并获得江西中医药大学实验动物伦理委员会的审批。

2 方法

2.1 试验模型制备与给药安排

大鼠先行1W的检疫，检疫合格后按下述方法进行水负荷筛选：每只大鼠按2.5 mL/100g灌蒸馏水，留置2 h的尿量，尿量大于给水量40%的实验鼠判为模型复制成功。将水负荷模型复制成功的40只大鼠，按体重、尿量随机分为生理盐水模型组、呋塞米阳性对照组(20 mg/kg)、生薏苡仁组(1 000 mg/kg)、法薏仁高(1 000 mg/kg)、法薏仁低剂量组(500 mg/kg)每组8只。实验前夜停止喂食16 h，不禁水，次日实验时各组大鼠按4 mL/100g给予1%NaCL溶液，制备盐水负荷模型。模型复制成功20 min后，按1 mL/100g口服给予相应剂量的药物。

2.2 指标检测

各组大鼠给药后，立即放入代谢笼中，每1 h、2 h、3 h、4 h、6 h收集1次尿液，共计5次，测量各时间点的尿量，检测各组大鼠各时间点尿液的pH和钠氯钾钙的量，计算离子浓度。尿液收集完成后以3%的戊巴比妥钠麻醉大鼠，搜集血样，3 000 r/min(离心半径：6 cm)进行10 min离心，获取上层血清对照ELISA试剂盒说明书进行操作，测定各组大鼠血清样本中醛固酮、心房钠尿肽等的含量，处死大鼠后，取出肾脏和脾，剪取肾髓质和脾，各置1.5 mL离心管中-80 ℃冻存待检AQP1,2,3基因表达水平。

2.3 AQP1,2,3基因的表达

2.3.1 RNA 抽取和反转录 使用RNA extraction kit 抽提RNA后，使用逆转录试剂盒反转录RNA获得cDNA存于-80 ℃冰箱。

2.3.2 荧光定量 PCR引物的设计和实时PCR 引物序列和PCR扩增反应参照文献[7]，内参基因选择 GAPDH。引物序列和反应体系见表1和表2。

混合后实验体系置于荧光定量PCR仪中反应， 扩增反应条件如下： 95 ℃ 30 s；95 ℃ 10 s，60 ℃ 1 min，40 个循环；然后反应体系由50 ℃到90 ℃ (每6 s增加1 ℃)；收集参考基因和目的基因的Ct值； 最后计算目的基因的相对表达水平，并按照Yang et al[8]实验方法对数据进行处理。

表1 RT-qPCR 的引物序列

表2 PCR反应体系

2.4 统计学处理

数据以均数±标准差(x±s)表示，通过SPSS 22.0统计软件进行处理，选择单因素方差分析(One way ANVOA)及LSD比较，结果中P<0.05表示经统计学运算，差异具有统计学意义。

3 结果

3.1 实验大鼠尿液量的变化

给药后1 h和2 h生薏苡仁和法薏仁低、高剂量组和阳性对照组大鼠的尿量与模型组比较有所增加，差异具有统计学意义(P<0.05)，且阳性对照组利尿效果最明显；给药后3 h法薏苡仁各剂量组大鼠尿量较生薏苡仁和阳性组多，差异达到显著水平(P<0.05)；但在给药后4 h和6 h后，各实验组尿量减少，但高剂量法薏仁和生薏苡仁尿量与阳性组相当，差异不具有统计学意义(P﹥0.05)。这表明薏苡仁不管是炮制前还是炮制后作用与呋塞米差不多。之后的每24 h的尿量，各实验组和阳性组尿量均高于模型组，法薏仁高剂量的利尿作用在48 h、110 h、134 h时高于阳性对照组，生薏苡仁的利尿作用基本与法薏仁低剂量相当。各组大鼠各时间点的尿量比较见图1，各组大鼠的总尿量比较见图1。

注：与模型组比较，*P<0.05

由图1可知，与模型组比较，薏苡仁经过炮制后法薏仁的利尿作用和呋塞米相当，并且与对照组大鼠比较差异具有统计学意义(P>0.05)，而炮制前的生薏苡仁虽然也具有利尿作用，但基本与法薏仁的低剂量的利尿作用相当，表明炮制后的薏苡仁利尿作用较强。

3.2 实验大鼠尿液pH酸碱度和Na+、K+、Ca2+、Cl-的变化

与模型组比较，薏苡仁和炮制品法薏仁和阳性对照组大鼠尿液中156 h 前Na+、Cl-、K+量无显著改变，差异不具有统计学意义(P>0.05)，但156 h 后，阳性对照组和法薏仁组的Na+、Cl-排出有显著差异，表明薏苡仁的利尿作用初期未改变Na+、Cl-、K+的水平，但后期有促进Na+、Cl-排出的作用。各组实验大鼠尿液的酸碱度差异无统计学意义(P>0.05)。

各组实验大鼠尿液中Na+、K +、Ca2+、Cl-浓度及酸碱度pH比较见图2和3。

图2 各组大鼠尿液中pH比较(x±s，n=10)

图3 各组大鼠尿液中Na+、K+、Ca2+、Cl-量比较(x±s，n=10)

3.3 实验大鼠血清中ALD、ANP和ADH含量的变化

法薏仁高、低剂量组、生薏仁和阳性对照组大鼠血清中ANP含量与对照组比较均呈增加趋势，法薏仁高、低剂量组和阳性对照组大鼠ALD含量显著下降，差异具有统计学意义(P<0.05)。法薏仁高、生薏仁组和阳性对照组大鼠抗利尿激素含量下降，差异未达显著水平(P>0.05)，提示法薏仁的利尿作用机制与大鼠血清中ANP的分泌增加、减少血浆ALD的含量有关，结果比较见表3。

3.4 大鼠肾AQP1,2,3的表达变化

水通道蛋白(Aquaporin)，又名水孔蛋白，是分布在细胞膜上的蛋白质，形成细胞膜 “孔道”，可影响水在细胞的进出，阳性对照组和法薏仁高剂量AQP1表达水平明显下降，且差异具有显著性(P<0.05)，AQP2在阳性对照组和生薏仁组表达下降，且差异具有显著性(P<0.05)，AQP3表达水平可见法薏仁高剂量组明显下降，且差异具有显著性(P<0.05)，反映出法薏仁和生薏仁对水通道蛋白的影响不一样。

4 讨论

薏苡仁是古老的药食两用，为历代中医最为常用的中药之一，其薏苡仁性味归经：甘、淡、微寒，归脾、胃、肺经，薏苡仁具有利水渗湿，健脾止泻，祛湿除痹，清热排脓作用。法薏苡仁饮片属于樟帮中药炮制特色产品，是按照中药炮制学理论,经过浸制，蒸制和炒制等数种复制后所得的薏苡仁炮制品种，其性由凉转微温，具有较好的健脾祛湿等效果[8-9]。本实验发现生薏仁和法薏仁高剂量和低剂量均能促进尿的排出，但未发现生薏仁和法薏仁对尿液中K+的分泌与尿液酸碱pH有比较明显的影响。

图4 法薏仁对盐水负荷的大鼠的水通道蛋白基因表达的影响

醛固酮ALD、心房钠尿肽ANP、抗利尿激素ADH都可以影响尿液生成与排出，本实验发现薏苡仁与呋塞米对ADH未见明显影响；生薏仁、法薏仁和呋塞米可促进ANP的分泌、减少血清ALD的含量。ANP分泌增加会抑制ALD的分泌，而ANP分泌增加及ALD减少均会促进Na+和水的排泄，从而也解释了法薏仁可增加盐水负荷模型大鼠尿量与尿液中Na+、Cl-的排出，生薏仁和法薏仁对尿液pH和K+未见明显影响。

存在于血液、肾脏、大脑等部位的水通道蛋白(Aquaporin，AQP)，具有选择性的让水分子通过的特性，其中AQP1,2,3,4与肾脏的尿液代谢有关[10]，选择AQP1,2,3的基因表达情况了解了薏苡仁的利尿作用的关系，可见薏苡仁和法薏仁影响了不同的水通道蛋白的基因表达，这可能与薏苡仁和法薏仁的利尿靶点不同有关。