反相二维液相色谱法测定不同烟草制品烟草和烟气中烟碱异构体比值

2022-06-27朱瑞芝司晓喜向能军徐艳群刘志华

烟草科技 2022年6期

朱瑞芝，司晓喜，王凯，蒋薇，杨继，向能军，徐艳群，李浪，刘志华，何沛*

1. 云南省烟草化学重点实验室云南中烟工业有限责任公司技术中心，昆明市五华区红锦路367 号 650231

2. 安捷伦科技（中国）有限公司，北京市朝阳区望京北路3 号 100102

加热卷烟通过加热烟草而非燃烧烟草产生主流烟气。和传统卷烟相比，加热卷烟无燃烧行为发生，减少了烟草高温燃烧过程裂解产生的有害成分，且侧流烟气和环境烟气的释放量也明显降低［1-5］。对于加热卷烟和传统卷烟2种不同的主流烟气产生方式，文献报道多集中于其主流烟气粒径分布的差异［6］、关键成分释放量的差异［7-9］等方面，但对于在主流烟气中R-（+）-烟碱和S-（-）-烟碱两种异构体释放量比值（R/S）的差异性则鲜有报道。烟碱是烟草和烟气中含量最丰富的生物碱，是烟草最重要的生理性活性成分，烟碱分子中含有一个手性中心，有2个代谢机理和生理特性完全不同的异构体［10-12］：S-（-）-烟碱和R-（+）-烟碱，烟草中的烟碱主要以S-（-）-烟碱存在，S-（-）-烟碱占烟碱总量的99%以上［13］。目前烟碱手性分离分析方法主要有气相色谱（GC）及气相色谱-质谱联用法（GC-MS）［13-16］、高效液相色谱法（HPLC）［17］、毛细管电泳法［18］、核磁共振法（NMR）［19-20］、电子圆二色谱法［21］、合相色谱-串联质谱法［22］等。由于烟草中烟碱两种异构体质量分数的差异极大，且烟草和烟气基质复杂，不利于烟碱异构体的分离和准确测定，通常的方法均需要复杂的前处理以减少基质的干扰。因此，本研究中采用中心切割-反相二维液相色谱法对烟草加热和燃烧状态下烟碱异构体的R/S进行研究，旨在揭示烟碱异构体在加热和燃烧2种状态下R/S的差异，并为吸烟与健康研究提供数据支持。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

传统卷烟、部分加热卷烟；云南中烟工业有限责任公司（简称云南中烟公司）出品加热卷烟由云南中烟公司技术中心提供。样品信息如表1所示。

表1 样品信息Tab.1 Sample information

甲醇、乙腈（色谱纯，德国Merck公司）；三乙胺、甲酸铵（AR，南京化学试剂股份有限公司）；乙酸（AR，国药集团化学试剂有限公司）；乙酸铵、二乙胺（AR，廊坊鹏彩精细化工有限公司）；外消旋体烟碱标准品，左旋烟碱［S-（-）-烟碱］和右旋烟碱［R-（+）-烟碱）标准品（＞99%，加拿大TRC公司）。

Agilent1260-Agilent1290二维液相色谱仪（美国Agilent 公司）；Milli-Q-Intergral5 超纯水仪（美国Millipore公司）；SHZ-88水浴恒温振荡器（金坛市医疗仪器厂）；BT125D 电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius 科学仪器有限公司）；KQ-700DB 数控超声波清洗仪（昆山市超声仪器有限公司）；具塞离心管（50 mL，德国Merck 公司）；一次性无菌注射器（5 mL，江苏治宇医疗器材有限公司）；有机相滤膜（0.22 μm，上海楚定分析仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 样品分析

1.2.1.1 烟气中烟碱异构体分析

取传统卷烟、加热卷烟（未经平衡），按加拿大深度抽吸模式［21］（加热卷烟固定抽吸8口，未进行通风阻塞）抽吸3支卷烟样品。将捕集主流烟气的剑桥滤片置于30 mL 的甲醇中，超声萃取40 min。取上清液，过有机相滤膜后，进行中心切割-二维液相色谱分析。

空白试验：向离心管中加入空白剑桥滤片，加入30 mL甲醇溶液，与上述处理方式相同，进行中心切割-二维液相色谱分析。

1.2.1.2 卷烟中烟碱异构体分析

称取0.2 g 烟草原料，置于30 mL 甲醇中，超声萃取40 min。取上清液，过有机相滤膜后，进行中心切割-二维液相色谱分析。

空白试验：离心管中不加烟草原料样品，直接加入30 mL 甲醇溶液，与上述烟草原料样品处理方式相同，进行中心切割-二维液相色谱分析。

1.2.1.3 中心切割-二维液相色谱分析条件

一维液相色谱条件：

色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell HPH-C18柱（4.6 mm×50 mm，2.7 μm）；流速：1 mL/min；流动相A：50 mmol/L的乙酸铵溶液；流动相B：甲醇。梯度洗脱条件见表2。

表2 梯度洗脱条件Tab.2 Gradient elution conditions

二维液相色谱条件：

Trap 柱：PoroShell EC-C18柱（4.6 mm×5 mm，4 μm）；手性色谱柱：Agilent InfinityLab Poroshell Chiral-T柱（4.6 mm×150 mm，2.7 μm）；流动相：V甲醇∶V乙腈=45∶55（甲醇为混合液：V甲醇∶V乙酸∶V三乙胺=100∶0.25∶0.05）；流速：1 mL/min；检测波长：259 nm；柱温箱温度：25 ℃；进样量：3 μL。

检测流程：一维色谱柱对进样样品进行富集净化（图1a），在3.8 min 切换阀位置（图1b），将目标物转移至Trap 柱，在4.0 min 切换阀复原（图1c）；二维流动相将目标物转移至二维色谱柱，二维色谱柱继续对样品进行分离分析。系统流路连接见图1。

图1 二维液相色谱工作流路图Fig.1 Flow charts of two-dimensional liquid phase chromatography

1.2.2 数据处理

采用Agilent OpenLAB 数据分析软件绘制标准工作曲线，获取回归方程和相关系数。

2 结果与讨论

2.1 一维色谱柱的选择

选择合适的一维色谱柱，既能把烟碱以外的杂质分离开，又有较好的保留。另外，需要有尽可能窄的色谱峰以利于获得更短的阀切换时间窗口。在相同洗脱条件下，对PoroShell Bonus-RP、Poroshell HPH-C18、PoroShell PFP、 PoroShell EC-C8及PoroShell SB-C85种色谱柱进行烟碱分离效果的比较，结果见图2。可知，HPH-C18柱对烟碱的保留性能和峰形均较好。最终选用Poroshell HPH-C18色谱柱作为一维色谱柱分离和富集烟碱。

图2 不同一维色谱柱对烟碱的分离效果Fig.2 Separation of nicotine by different one-dimensional chromatographic columns

2.2 Trap柱的选择

传统的中心切割二维液相色谱法采用大体积的定量环，收集并储存第一维目标组分，可能会造成第二维色谱柱严重过载，导致色谱峰变形、展宽等；也会出现切割体积超过样品环体积的情况，造成色谱峰丢失，从而影响准确定量［24］。本研究中采用Trap柱进行捕集，选用与一维色谱柱同型号的PoroShell HPH-C18Trap柱时，Trap柱的保留性不够，导致烟碱捕集不完全。最终选用PoroShell EC-C18Trap柱，能够达到很好的保留。

2.3 二维液相色谱条件的优化

为了实现烟碱异构体的手性分离，考察不同色谱柱及分离模式对烟碱异构体的分离效果，选择与反相色谱的流动相兼容的手性柱，对色谱条件以及流动相的比例、添加剂的种类和浓度进行优化。先后考察了 Agilent Chiral-T、Chiral-V、Chiral-CD 以及Daicel IA-3、IC-3共5种手性色谱柱，在反向色谱模式（Reverse phase chromatography，RP）下，选用合适的流动相及洗脱条件，实验中发现Agilent Chiral-T 柱对2 种烟碱异构体的分离度较好。由于烟碱是二元弱碱，在水溶液中以游离态、单质子态和双质子态存在，因此，用流动相洗脱时容易出现烟碱峰拖尾的现象［25］。在本研究中，通过加入一定量的添加剂改善烟碱分离效果。酸性添加剂选用乙酸和甲酸，在同样条件下，乙酸的分离效果更好；在含适量乙酸的流动相中分别加入二乙胺、三乙胺和乙酸铵进样分析，发现添加三乙胺的分离效果较好，二乙胺和乙酸铵相对乙酸的体系均表现较差。在流动相中添加乙酸-三乙胺的缓冲体系，具有重现性好、准确度和灵敏度高的特点，达到了改善峰宽和减少拖尾的效果。通过色谱条件的优化，分离度达到1.9以上，如图3所示。

图3 二维色谱柱的选择Fig.3 Selection of two-dimensional chromatographic columns

2.4 二维液相色谱图

图4、图5分别为外消旋烟碱标准溶液色谱图和典型卷烟烟气样品色谱图。可知，一维色谱图中1.0～10.0 min 为样品中的杂质峰，3.8～4.0 min 时，目标烟碱被精准切割，进入二维液相色谱，并在12.0 min～15.0 min出峰，S-（-）-烟碱和R-（+）-烟碱的基线分离较好，并且质量分数低的R-（+）-烟碱不受基质干扰。表明样品中目标物在一维色谱图中得到很好的富集和净化分离，消除了基质干扰；在二维色谱图中，S-（-）-烟碱和R-（+）-烟碱得到较好的基线分离。可见采用中心切割-二维液相色谱有效解决了烟草复杂基质干扰问题，操作简单，稳定性好，灵敏度高，准确度好，分析时间短，适用于复杂基质中烟碱异构体的分离及定量测试。

图4 外消旋烟碱标准溶液色谱图Fig.4 Chromatograms of standard solution of racemic nicotine

图5 典型卷烟烟气样品色谱图Fig.5 Chromatograms of typical cigarette smoke sample

2.5 标准工作曲线、回收率及检测限

对每个物质的最低浓度对应的标准溶液平行测定10 次，以测定结果标准偏差的3 倍为方法的检出限，使用烟草原料加标法和空白滤片加标法在低、中、高3 个浓度水平上测定回收率，结果见表3。S-（-）-烟碱和R-（+）-烟碱的相关性良好，烟草原料加标回收率在92.6%～105.8%之间，滤片加标回收率在89.1%～104.5%之间，方法的检出限在0.076～0.100 mg/L之间，表明本方法测定结果稳定可靠。

表3 方法的回归方程、相关系数、回收率和检出限Tab.3 Regression equations, linear correlation coefficients, recoveries and LODs of the method

2.6 方法的精密度

选取典型的烟草样品和卷烟样品，分别按照1.2节中方法对烟草和烟气样品进行5次平行测试，考察方法的精密度，结果如表4 所示。烟草样品S-（-）-烟碱和R-（+）-烟碱的RSD在0.52%～1.51%之间，烟气样品S-（-）-烟碱和R-（+）-烟碱的RSD在0.81%～2.61%之间，表明该方法的精密度良好。

表4 方法的精密度（n=5）Tab.4 Precisions of the method（n=5）

2.7 不同类型卷烟样品烟碱异构体的R/S分析

2.7.1 传统卷烟烟碱异构体的R/S

几种代表性传统卷烟样品烟草和主流烟气中烟碱异构体的R/S分析结果如表5所示。可知，不同品牌传统卷烟中，烟草中烟碱异构体的R/S约在0.16%～0.35%之间，主流烟气中烟碱异构体的R/S 约在1.44%～1.65%之间，主流烟气中烟碱异构体的R/S约是烟草中的4.05～9.71倍，可能原因是部分S-（-）-烟碱异构体在燃烧过程中发生消旋化所致［13］。

表5 传统卷烟烟碱异构体的R/STab.5 R/S ratios of nicotine isomers in conventional cigarette

2.7.2 加热卷烟烟碱异构体的R/S

几种代表性加热卷烟样品中烟草和主流烟气中烟碱异构体的R/S分析结果如表6所示。可知，中心加热卷烟烟草中烟碱异构体的R/S 约在0.09%～0.32%之间，显著大于周向加热卷烟，可能是由于两种类型加热卷烟配方的差异性导致。中心加热卷烟主流烟气中的R/S 是烟草中的1.65～2.00 倍，可能原因是中心加热卷烟工作温度一般在350～400 ℃之间，在加热过程中S-（-）-烟碱发生少量消旋化转化为R-（+）-烟碱，因此中心加热卷烟主流烟气中的R/S稍高于烟草。周向加热卷烟主流烟气中的R/S未能得到数据。两种类型加热卷烟主流烟气中的R/S存在显著差异的主要原因是烟草原料中烟碱原质量分数和加热温度的差异，一方面周向加热卷烟烟草原料中R-（+）-烟碱的质量分数较低；另一方面，低温下烟碱的整体转移率低，而低于250 ℃时，S-（-）-烟碱的消旋化不明显，导致捕集到的R-（+）-烟碱低于方法定量限。

2.7.3 传统卷烟与加热卷烟烟碱异构体R/S的比较

由表5、表6 可知，传统卷烟与加热卷烟烟碱异构体中R/S 的差异较大。传统卷烟烟草中烟碱异构体的R/S与中心加热卷烟差异不大，可能与传统卷烟和中心加热卷烟在配方结构上较为一致有关；而传统卷烟主流烟气中烟碱异构体的R/S 显著高于加热卷烟，造成这种差异的主要原因是S-（-）-烟碱的热消旋化［13］。由于目前市售加热卷烟的加热温度一般不超过400 ℃，而传统卷烟燃烧温度在600 ℃以上［26］，部分S-（-）-烟碱受热消旋转化为R-（+）-烟碱，因此，与烟草中相比，传统卷烟主流烟气中的R/S 增加明显。