李明雷，席 辉，付英杰，刘 雨，李 鹏，朴永革，孙世豪*，张建勋，李河霖*

1. 中国烟草总公司郑州烟草研究院，郑州高新技术产业开发区枫杨街2 号 450001

2. 吉林烟草工业有限责任公司，吉林省延吉市河南街天池路795 号 133001

有机酸是卷烟加料时施加到卷烟烟丝中的关键组分之一，能够有效调节卷烟烟气pH，改变烟气烟碱存在状态，从而降低烟气刺激性，使烟气吸味醇和［1-2］。然而有机酸在烟气中的粒相转移率和感官贡献度差异显著，低碳数的有机酸具有更高的转移率和感官贡献，其中，乙酸、乳酸、苹果酸、柠檬酸、富马酸等低碳数有机酸在卷烟烟气中的释放量受到较多关注［3-4］。此外，烟丝中含有的 Cl-、NO2-、SO42-和PO43-等无机阴离子会通过影响燃烧性能而影响卷烟的抽吸品质［5-7］，也常被作为卷烟设计中关注的化学指标。天然香料是一类重要的烟草添加剂，因其在赋予卷烟风格特征、改善卷烟抽吸品质方面的独特作用，被广泛应用于卷烟中［8-10］。有机酸和无机阴离子广泛分布于天然香料中，是天然香料的重要构成组分。然而，天然香料来源广泛、种类繁多、工艺多样，导致其中有机酸和无机阴离子的浓度差异较大［7,11］，这种差异不利于卷烟设计过程中天然香料的选择和搭配，进而可能影响卷烟品质。迄今为止，关于天然香料中有机酸和无机阴离子分布特征的研究并不多见。因此，了解天然香料中有机酸和无机阴离子的分布特征，对于天然香料的品质评价和卷烟调香时对天然香料的选用具有重要指导意义。

目前，气相色谱法和液相色谱法是烟用香精香料、烟草及烟草制品中有机酸和无机阴离子检测的主要方法［12］。采用气相色谱法进行分析时，需要对目标物进行衍生化，前处理过程复杂［11,13］；液相色谱方法中的离子色谱法，因前处理简单、无需有机试剂洗脱等成为分析工作者的首选［14-15］。鉴于此，本研究中采用超声辅助萃取-离子色谱方法定量考察了202种烟用天然香料中的5种有机酸和4种无机阴离子［16-17］，采用单因素方差分析和主成分分析法分析相关数据，获取了其在天然香料中的分布特征，并讨论产品类型和原料种类对天然香料中有机酸和无机阴离子分布特征的影响，旨在为天然香料的品质评价和卷烟调香时天然香料的选用提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂和仪器

参照GB/T 21171—2018［16］的方法自制天然香料样品，分别为圆柚精油（A）、香荚兰净油（B）、红枣酊（C）、葫芦巴油树脂（D）、可可提取物（E）、杨梅浓缩物（F）、红茶浸膏（G）；202种市售烟用天然香料样品由各省级中烟工业有限责任公司提供，包括91种精油产品（1～91 号）、12 种净油产品（92～103 号）、12 种酊剂产品（104～115号）、6种树脂产品（116～121号）、6 种浓缩物产品（122～127 号）、53 种提取物产品（128～180号）、22种浸膏产品（181～202号）。所有样品存放条件：温度（4.0±0.5）℃、相对湿度85%±2%。

DL-苹果酸二钠水合物（≥98.0%，色谱纯，上海阿拉丁科技股份有限公司）；富马酸（≥99.0%，优级纯）、柠檬酸钠（≥99.5%，AR）、亚硝酸钠（≥99.0%，高纯试剂）（北京伊诺凯科技有限公司）；乳酸（≥90.0%，AR，北京百灵威科技有限公司）；乙酸钠（≥99.0%，优级纯，美国Alfa Aesar 公司）；氯化钠（≥99.0%，AR，美国Sigma Aldrich 公司）；无水硫酸钠（≥99.5%，AR）、无水磷酸三钠（≥98.0%，AR）（天津市风船化学试剂科技有限公司）；实验用水经GenPure 超纯水仪处理，均为去离子水（电阻率＞18.2 MΩ·cm）。

ICS-5000 离子色谱仪（美国Thermo Fisher Scientific公司）；CP2245电子天平（感量0.000 1 g，德国Sartorius公司）；Transferpette S移液器（德国Brand公司）；GenPure 超纯水仪（美国Thermo Scientific 公司）；有机相针式滤器（尼龙，13 mm×0.22 μm，上海安谱实验科技股份有限公司）；KQ-800DE型数控超声波清洗器（昆山市超声仪器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 溶液的配制

标准混合储备液：分别准确称取一定量5 种有机酸和4 种无机阴离子标准样品，置于100 mL 容量瓶中，用去离子水定容。标准样品称量后需要转换为离子浓度，于4 ℃冰箱中保存。

标准工作溶液：在标准混合储备溶液的基础上，采用等比稀释的方式配制一系列浓度的标准溶液，即为标准工作溶液。

1.2.2 样品前处理

天然香料前处理：称取100.0 mg 样品于50 mL离心管中，加入25 mL 去离子水，30 ℃水浴条件下超声萃取30 min；取1 mL 上清液，经有机相针式滤器过滤后作为进样溶液，进行有机酸和无机阴离子的离子色谱定量分析。每个样品平行测定5 次，并计算相对偏差。色谱条件：

色谱柱：Dionex IonPac AS11-HC色谱柱（4 μm×250 mm）；保护柱：IonPac AG11-HC 阴离子保护柱（4 μm×50 mm）；柱温：30 ℃；电导检测器温度：35 ℃；进样量：25 μL；淋洗液：KOH 溶液；梯度淋洗程 序 ：0～10.0 min 1.25～9.00 mmol/L KOH，10.0～23.0 min 9.00～22.00 mmol/L KOH，23.0～30.0 min 22.00～50.00 mmol/L KOH，30.0～30.1 min 50.00～70.00 mmol/L KOH，30.1～35.5 min 70.00 mmol/L KOH，35.5～35.7 min 70.00～1.25 mmol/L KOH，35.7～41.0 min 1.25 mmol/L KOH；流动相：去离子水；流量：1.0 mL/min；抑制器电流：124 mA。

1.2.3 数据处理

利用Microsoft Excel 2010软件对数据进行分析处理；利用SPSS V 26.0软件对数据进行单因素方差分析（Analysis of variance，ANOVA），以P＜0.05 认为存在显著性差异；采用SIMCA-P软件进行主成分分析（Principal component analysis，PCA）。

2 结果与讨论

2.1 天然香料中有机酸和无机阴离子的超声辅助萃取-离子色谱法定量分析

标准工作溶液和自制天然香料样品A～G的色谱图如图1所示。由标准工作溶液的色谱图可知，5种有机酸和4种无机阴离子能够得到有效分离，且色谱峰形尖锐、对称、无拖尾现象。表明该离子色谱方法适用于天然香料样品中的有机酸和无机阴离子的分离。由自制天然香料样品的色谱图可知，5种有机酸和4种无机阴离子在自制天然香料中均有分布，但其信号强度存在差异，精油、净油和酊剂的色谱图信号强度较低。

图1 标准工作溶液和天然香料样品的色谱图Fig.1 Chromatograms of standard working solutions and natural flavor samples

2.1.1 标准曲线、检出限和定量限

以目标化合物的色谱峰面积与其浓度进行回归分析，得到5种有机酸和4种无机阴离子的线性回归方程及其相关系数，分别以信噪比的3 倍和10 倍确定方法的检出限（LOD）和定量限（LOQ），结果如表1所示。可知，5种有机酸和4种无机阴离子在各自线性范围内的线性关系良好（回归方程的R2均大于0.999），检出限和定量限的范围分别为5.3～27.2 ng/mL 和17.5～90.7 ng/mL，日内和日间相对标准偏差（RSD）的范围分别为0.66%～6.35%和1.25%～5.27%。因此，该方法的重复性、灵敏度和准确度较好，可满足5种有机酸和4种无机阴离子的定量检测要求。

表1 5种有机酸和4种无机阴离子的线性参数、检出限、定量限和相对标准偏差（n=5）Tab.1 Linear parameters, limits of detection, limits of quantification and relative standard deviations for 5 organic acids and 4 inorganic anions（n=5）

2.1.2 方法的回收率和精密度

参考文献［16-17］的方法进行样品前处理的选择和优化，采用超声方式辅助萃取天然香料样品中的有机酸和无机阴离子，选择溶剂体积为25 mL，水浴温度为30 ℃。天然香料样品G 中有机酸和无机阴离子的检测浓度随超声时间的变化见表2。可知，有机酸和无机阴离子的检测浓度随超声时间延长呈现先增加后平稳的趋势，30 min后所测浓度不再有明显变化。因此，选择超声时间为30 min。

表2 不同萃取时间时天然香料样品G中5种有机酸和4种无机阴离子的检测浓度Tab.2 Measured concentrations of 5 organic acids and 4 inorganic anions in natural flavor sample G with different extraction time （μg·mL-1）

选取不同类型自制天然香料样品通过加标的方式考察方法的回收率和精密度。方法对天然香料样品G中的有机酸和无机阴离子的回收率和精密度测试结果如表3所示。可知，9种目标物在不同浓度下的加标回收率在90.3%～98.2%之间，RSD 在0.99%～4.91%之间。采用相同的加标方式考察方法对样品A～F 的回收率和精密度，结果显示，不同浓度下9 种目标物的加标回收率在87.6%～108.0%之间，RSD在0.86%～7.58%之间。上述结果表明，该方法适用于不同产品类型天然香料中5 种有机酸和4 种无机阴离子浓度的批量检测。

表3 天然香料样品G中5种有机酸和4种无机阴离子的加标回收率和精密度 （n=5）Tab.3 Spiked recoveries and precisions of 5 organic acids and 4 inorganic anions in natural flavor sample G （n=5）

2.2 天然香料中有机酸和无机阴离子的分布特征

202 种天然香料中有机酸和无机阴离子浓度的检测结果见表4。乳酸、乙酸、苹果酸和柠檬酸在202种天然香料中的检出率分别为96%、62%、51%和48%，表明大多数天然香料中均含有一定量的有机酸。而富马酸仅在15种天然香料中检出，表明富马酸可能仅在很少一部分天然香料中存在。Cl-、SO42-和PO43-在202 种天然香料中的检出率分别为89%、74%和51%，表明大多数天然香料中均有一定的阴离子分布。而NO2-仅在4 种天然香料中检出，并且浓度低于0.012 mg/g。上述结果显示，部分有机酸和无机阴离子在天然香料中的分布特征具有广泛性，意味着在配制烟用香精时，天然香料的使用可能会对烟用香精中有机酸和无机阴离子的浓度造成影响。202 种天然香料中5 种有机酸和除NO2-之外的其他3种无机阴离子浓度的范围较宽、标准差系数较大，显示出天然香料中有机酸和无机阴离子的分布存在显著差异。上述分析结果显示，天然香料中有机酸和无机阴离子的分布特征具有广泛性和显著差异性，这种分布特征可能会影响天然香料的品质评价和卷烟调香时对天然香料的选用。

表4 202种天然香料样品中有机酸和无机阴离子浓度的描述统计分析结果Tab.4 Results of descriptive analysis of organic acids and inorganic anions concentrations in 202 natural flavor samples

2.3 不同产品类型天然香料中有机酸和无机阴离子的分布特征

根据 GB/T 21171—2018［18］中的定义，将 202 种天然香料分为精油、净油、酊剂、树脂、浓缩物、提取物和浸膏，分析不同产品类型天然香料中有机酸和无机阴离子的分布特征。结果如表5所示，同一产品类型天然香料中有机酸和无机阴离子的浓度范围较宽，这可能与其原料种类和加工工艺有关。不同产品类型天然香料中有机酸和无机阴离子浓度均值的单因素方差分析（Analysis of variance，ANOVA）结果显示：乙酸在浓缩物、浸膏和提取物中的浓度均值较高，在精油中的浓度均值最低，在其余产品类型天然香料中的浓度均值居中；乳酸在提取物、浸膏和酊剂中的浓度均值较高，在精油中的浓度均值最低，在其余产品类型天然香料中浓度均值居中；苹果酸、柠檬酸和PO43-在浸膏、浓缩物和提取物中的浓度均值显著高于精油、净油、酊剂和树脂；Cl-在提取物中的浓度均值最高，在精油中的浓度均值最低，在其余产品类型天然香料中的浓度均值居中；SO42-在浸膏、树脂和提取物中的浓度均值较高，在精油和净油中的浓度均值较低。结果表明，天然香料中有机酸和无机阴离子的分布特征可能与天然香料样品的产品类型相关。根据不同产品类型天然香料中有机酸和无机阴离子的浓度差异，可以将天然香料初步分为3类：第一类是有机酸和无机阴离子浓度均值较低的精油和净油；第二类是有机酸和无机阴离子浓度均值居中的酊剂和树脂；第三类是有机酸和无机阴离子浓度均值较高的浓缩物、提取物和浸膏。

表5 202种不同产品类型天然香料样品中有机酸和无机阴离子浓度的描述统计分析结果①Tab.5 Results of descriptive analysis of organic acids and inorganic anions concentrations in 202 natural flavor samples of different product types （mg·g-1）

202 种天然香料中有机酸和无机阴离子的主成分分析结果如图2所示。可知，第一、第二主成分方差贡献率分别为84.1%和4.1%，总方差贡献率为88.2%，表明主成分分析结果可说明天然香料样本的整体情况。精油和净油样品大多数呈现聚集现象并相互重叠；浓缩物、提取物和浸膏样品大多数也呈现聚集现象并相互重叠；酊剂和树脂样品则较为分散，在两类聚集体中各有分布。天然香料产品类型的不同导致其中的有机酸和无机阴离子分布存在一定差异，精油和净油与浓缩物、提取物和浸膏差异明显，酊剂和树脂与精油、净油、浓缩物、提取物和浸膏难以区分，这与上述不同产品类型天然香料中有机酸和无机阴离子浓度的描述统计分析结果相一致。表明天然香料中有机酸和无机阴离子的分布特征可以作为区分天然香料产品种类的重要指标，并且通过主成分分析方法有可能实现市售天然香料产品类型的鉴定。

图2 202种天然香料样品中有机酸和无机阴离子浓度的主成分分析得分图Fig.2 Principal component analysis scores of organic acid and inorganic anion concentrations in 202 natural flavor samples

不同产品类型天然香料中有机酸和无机阴离子的分布特征可能与其对应的提取方式相关。精油通常是采取蒸馏、压榨等提取方式获取油水混合物，再通过油水分离除去水相，这可能导致易溶于水的有机酸和无机阴离子损失，造成其在精油中的浓度较低［17］。酊剂和净油是采用乙醇等有机溶剂对天然原料或浸膏等萃取得到的产物，有机酸和无机阴离子在部分溶剂中的溶解度受限，即其在溶剂中的浓度较低［20］。树脂类样品是将天然渗出的油树脂尽可能除去挥发性组分后得到的产物，有机酸和无机阴离子在除去挥发性组分的过程中会有所损失，即其中有机酸和无机阴离子的浓度同样较低。而浓缩物、提取物和浸膏是采取浓缩富集的方式制备的，最大程度上保留了原料中的有机酸和无机阴离子［21］。通过离子色谱方法获取的数据很好地反映了不同产品类型天然香料的上述特征。

2.4 不同原料种类天然香料中有机酸的分布特征

将202种天然香料按照原料种类进行区分，选取其中同一原料种类数量较多的柑橘类（苦橙油、柠檬油、圆柚油等12种）、辛香料类（肉桂皮油、丁香油、八角茴香油等13种）、枣类（大枣浸膏、红枣净油、冬枣提取物等13 种）、茶叶类（巴拉圭茶提取物、绿茶浸膏、红茶浸膏等8种）、梅子类（话梅提取物、梅子提取物、乌梅浸膏等6种）和烟草类（巴西烟草提取物、津巴布韦烟草提取物、白肋烟浸膏等17种）6个原料种类共计69 种天然香料进行有机酸浓度描述统计分析，结果如表6所示。可知，同一原料种类天然香料中有机酸浓度的范围较宽，这可能与其原料来源、提取方式和加工工艺相关。不同原料种类天然香料中有机酸浓度均值的ANOVA分析结果显示：辛香料类和柑橘类天然香料中乙酸、乳酸、苹果酸和柠檬酸的浓度均值显著低于其余类天然香料；枣类、茶叶类天然香料中乙酸和乳酸的浓度均值较高，苹果酸和柠檬酸的浓度均值居中；梅子类天然香料中乳酸的浓度均值较低，乙酸、苹果酸和柠檬酸的浓度均值较高，其中，柠檬酸的浓度均值是其余原料种类天然香料的20倍以上；烟草类天然香料中柠檬酸的浓度均值居中，乙酸、乳酸和苹果酸的浓度均值较高。富马酸仅在枣类天然香料中有检出，但浓度均值相对较低。结果显示，不同原料种类天然香料中有机酸的浓度均值存在一定差异，天然香料中有机酸的分布特征与原料种类关系密切。文献中显示，柑橘类和辛香料类天然香料的成分主要是柑橘果皮和辛香料中的萜烯类化合物，有机酸的浓度则较低［19,22］。富马酸作为枣类原料中的特征有机酸类成分［23］，在13种枣类天然香料中的检出率高达69.2%，而在其余189种中的检出率仅有3.2%。青梅类原料中的柠檬酸在其有机酸总浓度中的比例高达90%［24］，这可能是梅子类天然香料中柠檬酸的浓度均值显著高于其他类天然香料的原因之一。烟草类天然香料中除富马酸外的其他4 种有机酸浓度均值居中，这一结果与乙酸、乳酸、苹果酸以及柠檬酸广泛分布在烟叶中的结论相一致［6］。

表6 不同原料种类天然香料样品中有机酸浓度的描述统计分析Tab.6 Descriptive analysis of organic acid and inorganic anion concentrations in natural flavor samples with different raw materials （mg·g-1）

3 结论

①天然香料中有机酸和无机阴离子的分布特征具有广泛性和差异性。②天然香料中有机酸和无机阴离子的分布特征与产品类型相关，浓缩物、提取物和浸膏中的有机酸和无机阴离子浓度均值高于精油和净油，酊剂和树脂中有机酸和无机阴离子的浓度均值居中，这可能是由于不同产品类型天然香料对应提取方式存在差异所导致的结果。③天然香料中有机酸的分布特征与原料种类相关，枣类天然香料中的富马酸浓度均值和梅子类天然香料中的柠檬酸浓度均值高于其他原料种类的天然香料，这可能是由于原料自身所含有机酸浓度存在差异所导致的结果。④天然香料中有机酸和无机阴离子的分布特征可以作为天然香料品质评价的指标，为卷烟调香过程中天然香料的选择提供参考。