王 敏

（阜阳职业技术学院，安徽 阜阳 236031）

我国是农业大国，大豆秸秆、玉米秸秆和油菜秸秆在我国产量大，是农业生产的残留物。阜阳是重要的农副产品生产基地，秸秆资源丰富。大豆、玉米和油菜等农作物秸秆含有丰富的营养物质，但其化学结构复杂，不易被降解。因此，仅有少量用于生产纸张和饲料等行业，秸秆被随意抛弃、放火焚烧秸秆现象依然很严重，影响人民的身体健康。这就会造成资源的浪费，增大环境污染治理难度。随着科学研究的深入，研究者发现可以采用物理和化学方法处理降解部分秸秆，但由于实际生产成本、操作和环境污染等原因，推广使用范围较小。后来研究发现，秸秆中木质素也可以利用微生物进行转化。木质素是一种大分子芳香族化合物。在木质素降解方面，白腐菌被公认是降解能力很强的微生物。胞外氧化酶的产生是降解木质素的能力的基础。木质素降解酶系统主要有过氧化物酶和漆酶构成，其酶活性影响秸秆的降解程度。白腐真菌作为能降解木质素的微生物，受到了人们的广泛关注。

张芳芳研究表明，玉米秸秆可以通过白腐真菌被降解，同时白腐真菌还能用于对污染水体的生物修复。我们只有了解白腐真菌的生长习性，才能充分发挥其作用，为环境的改善做出一定的作用。

白腐菌对秸秆的降解能力在很大程度上要依赖于培养条件。培养发酵的条件不同，降解秸秆能力也可能出现差异。内外环境因素影响白腐真菌的生长。培养基中碳氮源和金属离子影响真菌代谢活动，进而影响真菌菌丝生长及降解酶的分泌量。筛选出适合的培养基有利于提高酶活性，这是白腐真菌降解秸秆和污染物的基础。香菇、杏鲍菇、平菇属白腐真菌，本文通过培养基的优化，观测不同因子对白腐真菌的生长及漆酶分泌的影响，对白腐真菌降解秸秆和污染水体的修复具有一定的意义。

1.材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验菌种：平菇、香菇、杏鲍菇（学院选育）。

1.1.2 秸秆：玉米秸秆、大豆秸秆、油菜秸秆。

1.1.3 设备仪器：移液枪；高压蒸汽灭菌器；高速离心机；隔水式电热恒温培养箱；超净工作台；电热恒温水浴箱；分光光度计；粉碎机；电子天平。

1.1.4 活化和发酵培养基：PDA 培养基：用于菌种保存和活化。

液体种子基础培养基：刨皮马铃薯100g，切成2cm左右方块置于锅中，加热煮沸15min，用纱布将汁滤于大烧杯中，滤液补水到1L。在马铃薯滤汁中再分别加人20g葡萄糖、蛋白胨2g、NaH2PO41.5g、MgSO40.75g、酵母粉1.5g，混匀全部溶解后补水至1L，分装于250mL 锥形瓶中，0.15MPa、121℃高压灭菌25min。

秸秆发酵培养基：大豆秸秆粉、玉米秸秆粉和油菜秸秆粉用以下1-6 种培养基进行试验，添加秸秆粉量如下表1 所示。每种秸秆固体培养基中按表1 配方各加入20 克琼脂。

表1 秸秆粉液体培养基配方

1.2 实验方法

1.2.1 基质处理。秸秆取自阜阳颍州区周边农家，选择自然风干的无霉变秸秆粉碎成0.5mm 颗粒，灭菌处理，备用。

1.2.2 菌种制备及深层培养方法。从斜面试管中将菌种接种在灭菌平板培养基上，放入恒温培养箱中培养，设定温度为28℃，培养时间为8 天。待平板培养基菌丝占据1/2 平板后，用打孔器将直径5mm 的接种物放入秸秆发酵培养基1-6 中进行试验，观察各平板上菌丝生长的均匀性。以菌丝体日平均生长量和生长势为指标，选择了一种较好的液体深层培养基配方。

液体深层培养：菌丝体在平板上生长后，取直径5mm 的接种物，将五个接种块放入添加大豆秸秆和油菜秸秆的培养基、碳源培养基和氮源培养基中，在无菌条件下，将五个接种块放入每100ml 液体培养基中，并在28℃下以150r/min 的速度摇床12 天。每个实验重复3 次。

1.2.3 菌丝体生物量的测定。发酵8 天后，用蒸馏水清洗真菌球上未过滤的秸秆粉，以每分钟3000 转的速度离心15 分钟，然后置于65℃烘箱中干燥。用天平称量其菌丝干重，把3 次平均值记作每种培养基的菌丝体干重量。通过菌丝体干重与培养基体积之比，计算出菌丝体生物量。

1.2.4 粗酶液的制备。在无菌条件下，每48 小时移取发酵液体。发酵液经单层滤纸过滤后，以每分钟4000 转离心10 分钟，上清液为粗酶液。每个样品分别取样3 次。

1.2.5 漆酶(Lac)活性检测。以3，3’-二甲基联苯胺为底物，在比色皿中加入0.01mol L-1·的pH 值为4.0 醋酸盐缓冲液3.4ml 和0.5ml 一定浓度的3，3-二甲基联苯胺，混匀后加入0.1ml 稀释酶溶液，检测在25℃恒温水箱反应5min 时600nm 处吸光值。将样品在沸水中煮15min 后酶液为对照，将单位时间内吸光值的变化表示酶活变化。单位时间内每毫升OD 值改变0.01，作为一个酶活单位。

2.结果与分析

2.1 不同配方对白腐真菌生长的影响

表2 显示了在液体培养基中添加不同量的秸秆粉培养条件下，对白腐真菌菌丝体均匀度和菌丝体生物量的影响。

表2 白腐真菌在不同培养液条件下的培养结果

本次研究中，主要抽选了大豆秸秆、油菜秸秆、玉米秸秆作为白腐真菌培养的基质。通过表2 可知，试验所选的3 种秸秆粉添加量均有利于白腐真菌菌丝生长，尤其是当添加20g/L 大豆秸秆和20g/L 油菜秸秆培养基时，菌丝生物量是对照组的三倍。处理5 的菌丝生物量最大，培养后菌丝球大小均匀。处理5 的菌丝生物量与其他处理显著不同。综合分析表明，处理5 更适合三种白腐菌的液体培养。后期液体发酵培养基选用处理5 配方。

由上述实验表明，在白腐真菌生长培养时加入一定量的秸秆粉，能为其生长提供所需的养分，对白腐真菌的生长具有一定的促进作用，从而使白腐真菌能够更加快速的生长。白腐真菌在不同秸秆中生长状况的差异，可能是由于不同的秸秆中所含的营养成分不同。

2.2 碳源对白腐真菌分泌漆酶的影响

碳源是真菌的碳骨架和能量来源。限制碳源不利于微生物的生长。碳源在真菌的生长中起着非常重要的作用。

本实验研究了不同碳源对白腐菌生长的影响。以尿素为氮源，用5 个2%的碳源代替基本培养基中的葡萄糖。以蔗糖、可溶性淀粉、麸皮、纤维素和玉米粉为碳源，置于28℃培养，并于第12 天取样测定漆酶活性。

结果表明，在选择的碳源中，麸皮为碳源时漆酶活性最高，其次为纤维素和葡萄糖。麦麸中含有丰富的纤维素、木质素、维生素等物质，在平菇、香菇、杏鲍菇培养基中添加一定量的麸皮，能促进漆酶的分泌。这可能是由于木质素能作为漆酶的诱导剂，在一定程度上促进了漆酶的产生。因此，在培养过程中可以看到添加麸皮的培养基中漆酶活性较高。从实验结果看，麦麸是平菇、香菇、杏鲍菇产生漆酶的较好碳源。

2.3 氮源对白腐真菌分泌漆酶的影响

本次实验以尿素、硫酸铵、硝酸铵、酒石酸铵、酵母浸膏为不同氮源，观测香菇、平菇、杏鲍菇在不同氮源作用下的生长情况。三种白腐真菌在各种氮源培养基中生长到12 天时进行漆酶活性测定。氮源培养基以麸皮为碳源。

图2 中显示，在试验选定的几种氮源中，当酵母抽提物为氮源时，香菇、平菇、杏鲍菇漆酶活力都达到较高值，若选NH4NO3为氮源时漆酶活力较差，这表明酵母抽提物可以作为最适合酶生产的氮源，酒石酸铵和蛋白胨也是较好的氮源，产生的酶活性与酵母抽提物差距不明显。氮源的消耗直接影响木质素降解酶的产生，木质素降解酶是一种次生代谢酶。在自然状态下，通常在氮源耗尽时产生。

2.4 铜离子对白腐真菌分泌漆酶的影响

漆酶的活性中心是由四个铜离子组成。铜作为漆酶蛋白的重要结构成分，不仅影响漆酶的活性和稳定性，而且是诱导漆酶产生的重要因素。

如图3 所示，铜离子添加一定量，能提高漆酶活性，浓度增至50mg/L 以上时，会转变为抑制漆酶合成。当Cu2+在20～40mg/L 浓度范围时，酶活性与对照相差不明显。这可能是因为低浓度时Cu2+只与酶表层附近的基团有结合作用，几乎对漆酶的结构没什么影响，对漆酶内部呼吸链传递影响不大，使得激活效果不明显。

当Cu2+在50mg/L 时，香菇、平菇、杏鲍菇的漆酶活性相对较高。当Cu2+浓度超过50mg/L 时，这三种菌株漆酶活性反而降低了。这可能是由于酶的活性中心结合点被饱和，高浓度的Cu2+与酶的活性中心外的结合点增多，过多的结合点也会改变酶的结构，影响电子传递，出现漆酶从高活性状态激活变为低活性，随着底物消耗，酶活性出现抑制现象。铜缺乏和铜限制不利于漆酶的合成。Cu2+可能通过与漆酶中的酸性氨基酸残基相互作用或通过影响漆酶的电荷平衡来影响漆酶活性。这可能是由于漆酶基因的转录需要铜离子来合成蛋白质。

3.讨论

本实验研究中分别选择6 种不同的碳源和氮源，考察对漆酶活性影响。试验表明，同一种酶在不同营养条件下其活性不同。在不同培养条件下，香菇、平菇、杏鲍菇分泌的漆酶活性也有差异，一方面可能是由于不同菌株具有生理上差异，另一方面可能是不同的培养体系对不同菌株木质素降解酶的分泌影响不同。因此，合理的物质配比对白腐菌的生长和木质素降解酶的分泌有着决定性的影响。

不同的因子影响着白腐真菌的不同方面，其中较为重要的就是培养基。培养基是白腐真菌得以生存发展的基础，培养基质、碳源、氮源、金属离子等都对白腐真菌的生长有一定的影响，只有研究好白腐真菌的影响因素，才能更好的培育白腐真菌，使之运用到更加广泛、更需要的环境之中。木屑、腐烂的树枝、农业废弃物等都可以作为白腐真菌培养的原料，我们可以充分利用白腐真菌培养的容易性，对白腐真菌进行培养，使白腐真菌能更多的为保护环境而做出努力。