梁芷珊，康信煌，吴育廉，张国光，何兰珍，邓春梅

(广东海洋大学，化学与环境学院，广东 湛江 524088)

骨骼在意外跌倒、车祸和运动创伤中经常会引起扭伤、折断，甚至破碎等问题。在骨骼受到损坏时，目前最为常用的临床医疗手段就是自骨移植、异骨移植和用金属材料进行替换[1]。这些临床治疗方法无一例外都给患者带来手术的痛苦和风险。因此，研发一种安全、有效，以及能减轻患者痛苦的骨骼医治方法具有很大的前景。本文利用肽促进伤口愈合、促进软骨细胞和成骨细胞增殖的特性，以期在轻微骨折时可注射含鲎血水解肽的温敏性水凝胶[2]，从而加快软骨组织和骨骼的自我恢复。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

马弗炉、低温高速离心机、冷冻干燥机、紫外分光光度计、恒温磁力搅拌器、扫描电镜、热重分析仪。

壳聚糖、β-甘油磷酸钠、醋酸、鲎血水解蛋白、胰蛋白酶、考马斯亮蓝G250、氯化钾、氯化钠、三水合磷酸氢二钾、氯化钙、六水合氯化镁、磷酸氢二铵。

1.2 实验方法

1.2.1 壳聚糖/牡蛎壳羟基磷灰石水凝胶的制备

根据专利,制得壳聚糖牡蛎壳羟基磷灰石温敏性水凝胶[3]。

1.2.2 鲎血水解蛋白的制备

根据专利，得到鲎血水解蛋白[4]，再制得实验所用的0.2%的鲎血水解蛋白溶液。

1.2.3 水凝胶最适含肽量的测定

取5个干燥小烧杯，分别放入 10 mL 上述的壳聚糖/牡蛎壳羟基磷灰石水凝胶溶液，置于 30 ℃ 恒温磁力搅拌器中搅拌,分别加入0.2%鲎血水解蛋白肽 0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL,通过记录水凝胶在 37 ℃ 恒温下的凝胶时间来表征水凝胶的好坏。

1.2.4 鲎血水解蛋白的体外释放率

根据考马斯亮蓝法，测定水解蛋白的释放率。取制备好的水凝胶一小块，放入透析袋中，再置于 10 mL pH=7.4的PBS中浸泡，并在磁力恒温水浴中 37 ℃ 恒温搅拌。在0、1、2、4、8、12、24 h 时各取出 1 mL 浸泡液，同时加入等量的PBS溶液。通过紫外分光光度计测各个时间点浸泡液的A595,计算水凝胶的鲎血蛋白累计释放率，并绘制蛋白释放曲线。计算公式为[5-6]：

累计释放率=[CnV1+(∑Cn-1)×V2]/m

(1)

式中：V1为PBS总体积；V2为PBS置换体积；Cn为第n次置换PBS后溶液中的蛋白质量浓度；m为水凝胶中含有鲎血蛋白的质量。

1.2.5 水凝胶的吸水度

将1.2.3制得的水凝胶，放入冰箱中冷冻 12 h，再将其冷冻干燥。取一定量的干燥水凝胶，称重为W0，置于装有蒸馏水的烧杯中。等待水分吸收充分后，将其取出，并用吸水纸吸干其表面水分，称重为Wt,计算吸水度(R)[7-10]。

(2)

1.2.6 水凝胶的体外降解度测定

分别取 0.112 g KCl、3.998 g NaCl、0.177 g NaHCO3、0.036 g Na2SO3、0.278 g CaCl2、0.114 g 三水合磷酸氢二钾、0.153 g 六水合氯化镁，置于烧杯中，加入适量去离子水，并将其搅拌均匀，待完全溶解后用 500 mL 容量瓶定容，并调pH至7.4，得到人体模拟液[10-11]。将8组在 37 ℃ 下凝胶的水凝胶分别置于人体模拟液中，并定时更换溶液，在0、1、2、4、8、12、24 h 时，分别测量水凝胶质量，其降解率[12]为：

(3)

式中：W0为水凝胶的初始质量，Wt为水凝胶降解后的质量。

1.2.7 电镜扫描

将1.2.6在人体模拟液中浸泡0、2、8、24 h 的水凝胶放进冰箱冷冻，待其结成冰后放进冷冻干燥机中冷冻干燥，将干燥的4组样品进行电镜扫描，在喷金 200 s,15 kV 加速电压条件下对4组水凝胶样品进行表面观察[12]。

1.2.8 热重分析

将无羟基磷灰石无鲎血水解蛋白，无羟基磷灰石有鲎血水解蛋白，有羟基磷灰石无鲎血水解蛋白，有羟基磷灰石有鲎血水解蛋白4组水凝胶进行热重(TG)和差热热重(DTG)分析，条件为氮气载气流量为 20 mL/min，升温速率 20 ℃，温度为常温到 600 ℃[13,15]。

2 结果与分析

2.1 水凝胶最适水解蛋白含量

不同水凝胶的凝胶时间见表1所示。

表1 不同水凝胶的凝胶时间

水凝胶体内凝胶的时间不宜过长，也不宜过短，因此最适含肽量为 0.6 mL,即每 10.6 mL 的水凝胶含肽量为 1.2 mg。制得的鲎血蛋白水凝胶如图1所示。

图1 含鲎血蛋白水凝胶

2.2 鲎血水解蛋白释放率

紫外分光光度计测各个时间点浸泡液的A595,计算水凝胶的鲎血蛋白累计释放率，并绘制蛋白释放曲线，如图2所示。通过计算，24 h 内水凝胶中的鲎血水解蛋白的累计释放率达71.44%.

图2 水凝胶中鲎血水解蛋白累积释放率曲线(24 h内)

2.3 水凝胶的吸水率

3组水凝胶的吸水率和平均吸水率如表2所示。

表2 不同水凝胶的吸水率和平均吸水率

由此得出，鲎血水解蛋白水凝胶具有良好的吸水性。

2.4 鲎血水解蛋白水凝胶的体外降解度

8组水凝胶的平均质量变化如图3所示。

图3 水凝胶24 h质量变化曲线

由图3可见，将水凝胶置于人体模拟液中，0～3 h 质量变化速率最大，在3～8 h 中质量变化较缓和一些，在8～24 h 中质量变化速度较快。最后测得8组水凝胶的平均降解率为50.04%。

2.5 扫描电镜

对4组鲎血水解蛋白水凝胶进行电镜扫描可见：没有在人体模拟液中浸泡过的水凝胶，表面空隙结构比较紧密，网孔数目较少；在400×电镜下孔径与其他3组的实质孔径大小一致，区别在于其表面没有被降解，表面结构紧密(图4)。在人体模拟液中浸泡 2 h 的水凝胶，表层被降解后，可看见水凝胶内部较为疏松的三维网络结构，网孔数目多，网孔完整(图5)。在人体模拟液浸泡 8 h 后的水凝胶，可看到表层被降解为一层透明的薄膜，表面网孔变大(图6)。在人体模拟液浸泡 24 h 后的水凝胶，可明显看见网孔被降解变大，表面变成网状细丝(图7)。

图4 0 h水凝胶在100×和400×下的表面SEM图

图5 2 h水凝胶在100×和400×下的表面SEM图

图6 8 h水凝胶在100×和400×下的表面SEM图

图7 24 h水凝胶在100×和400×下的表面SEM图

2.6 热重分析

由图8中TG曲线可见，水凝胶的总质量损失率为51.42%。壳聚糖水凝胶DTG曲线显示，分解分为三个阶段[3]，第一阶段的分解出现在 92.73 ℃ 左右，这个阶段主要是脱去水凝胶中的水分；第二阶段分解发生在 194.73 ℃ 附近，壳聚糖结构单元间的糖苷键开始断裂；第三阶段发生在 271.23 ℃ 左右，壳聚糖的主链断裂，水凝胶开始氧化、分解、炭化。从DSC曲线看到，在 105.23 ℃ 处出现吸热峰，吸热过后是一个放热过程。

图8 无羟基磷灰石无鲎血水解蛋白的壳聚糖水凝胶的TG-DTG曲线和DSC曲线

无羟基磷灰石、有鲎血水解蛋白的壳聚糖水凝胶TG-DTG曲线和DSC曲线如图9。

图9 无羟基磷灰石有鲎血水解蛋白的壳聚糖水凝胶的TG-DTG曲线和DSC曲线

从图9中TG曲线可知，水凝胶的总质量损失率为45.02%。与无鲎血水解蛋白的水凝胶相比，鲎血水解蛋白能降低壳聚糖的热损失率，能有效提高水凝胶的热稳定性。鲎血水解蛋白对水凝胶的第一阶段分解的起始温度影响较大(第一阶段的分解温度降低至 79.05 ℃ 左右，第二阶段分解发生在 183.55 ℃，第三阶段分解在 276.55 ℃ 附近)。水凝胶在 87.55 ℃，出现吸热峰，与无鲎血水解蛋白水凝胶低了 17.68 ℃。

由图10可知：羟基磷灰石无鲎血水解蛋白的水凝胶的TG曲线显示，该水凝胶的总质量损失率为54.21%。DTG曲线显示，羟基磷灰石提高了水凝胶第一段的分解温度，即第一阶段出现在90～130 ℃ 附近，且在 106.58 ℃ 时达到分解最大速率。与无羟基磷灰石的水凝胶相比，分解的最大速率从第三阶段变为第一阶段，第二阶段分解发生在 193.08 ℃ 附近，第三阶段发生在 274.08 ℃ 左右。从DSC曲线中看出，有羟基磷灰石，无鲎血水解蛋白的水凝胶在 117.58 ℃ 处出现吸热峰。

图10 有羟基磷灰石无鲎血水解蛋白水凝胶的TG-DTG曲线和DSC曲线

图11中TG-DTG曲线显示，水凝胶的总质量损失率为54.01%；有羟基磷灰石和鲎血水解蛋白的水凝胶第一阶段的分解同样出现在90～120 ℃ 附近，100.31 ℃ 时有最大分解速率，在 276.39 ℃ 时发生第二阶段分解，第三阶段的氧化炭化分解在 276.39 ℃，较无鲎血水解蛋白的水凝胶的温度稍微提升，说明鲎血水解蛋白的抗氧化作用在水凝胶中有显现，一定程度上提高了水凝胶的热稳定性。从DSC曲线可见，水凝胶在 116.82 ℃ 出现吸热峰。

图 １１ 有 羟 基 磷 灰 石 有 鲎 血 水 解 蛋 白 水 凝 胶 的 ＴＧ － ＤＴＧ 曲 线 和 ＤＳＣ 曲 线

3 结论

鲎血蛋白水凝胶具有良好的外观形态;壳聚糖是较好的药物载体，能够将骨修复的羟基磷灰石和鲎血水解蛋白释放到骨骼损伤处，蛋白释放率较高；同时鲎血水解蛋白水凝胶具备较好的吸水性和降解能力。羟基磷灰石能影响水凝胶第一阶段的分解温度，水解蛋白能提高水凝胶第三阶段分解的温度，降低水凝胶的总质量损失率，提高水凝胶的热稳定性。