师志海，王文佳，孟红丽，王亚州，闫祥洲，邱祥琦，程 燕，滑留帅，施巧婷，徐照学*

(1.河南省农业科学院畜牧兽医研究所 河南省畜禽繁育与营养调控重点实验室/郑州市兽医生物信息重点实验室，河南 郑州 450002；2.河南牧业经济学院 动物医药学院，河南 郑州 450046)

腹泻是导致犊牛死亡的主要原因，尤其对断奶前犊牛影响最为显著，给养牛业带来巨大经济损失。腹泻病因复杂，病毒、细菌[1]、寄生虫和日常饲养等因素都可能引起犊牛腹泻。牛嵴病毒(bovine kobuvirus，BKoV)可在健康犊牛的消化系统中存活，但近年来报道健康和腹泻犊牛粪便中BKoV的检出率差异较大[2]，提示BKoV与腹泻可能存在一定关联。

BKoV是小核糖核酸病毒科(Picornavirusfamily)、嵴病毒属(Kobuvirusgenus)成员，为单股正链无包膜RNA病毒，基因组全长约8.3 kb。2003年，BKoV U-1株首次在含10%犊牛血清的细胞培养物中被鉴定[3]。目前，BKoV已在全球四大洲13个国家的粪便样本中检出[4]，表明BKoV已在世界范围内广泛存在。我国西北地区、中部地区和东北地区等主要的牛养殖集群区也有BKoV流行[5]。BKoV是否能够引起犊牛发生消化系统感染，目前尚无定论，但越来越多的研究证据表明BKoV可能是牛犊腹泻的常见病原体之一[6]。有学者利用二代测序技术(next-generation sequencing，NGS)在11日龄持续低烧的犊牛脑脊液中检测出BKoV，表明该病毒还可引起全身感染[7]。

目前，有关BKoV在我国牛群中的发病情况、致病性及分子流行特征等信息较为缺乏。本研究基于BKoV的3D基因，利用荧光探针建立快速检测BKoV的方法，以期为BKoV在我国犊牛群中的流行现状和与犊牛腹泻的关联探究提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 毒株及被检样品BKoV、牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛星状病毒由本实验室保存。221份粪便样本采集自河南地区出现腹泻症状的犊牛，样本置-80℃超低温冰箱保存。

1.2 主要试剂及仪器病毒RNA提取试剂盒，cDNA一链合成试剂盒，pMD18-T载体，2×Premix Ex Taq(Probe qPCR)等购自TaKaRa公司；质粒小提试剂盒，购自宝生物工程有限公司。

实时荧光定量PCR仪，购自上海宏石医疗科技公司；梯度PCR仪，购自TaKaRa公司；超微量分光光度计，购自赛默飞世尔科技公司。

1.3 引物设计及探针根据GenBank 登录的BKoV基因系列，针对BKoV 3D基因的保守序列，设计特异性引物和荧光集团标记的探针(表1)，引物由擎科生物科技有限公司合成。

表1 BKoV引物及荧光探针序列

1.4 实时荧光定量PCR方法的建立

1.4.1质粒标准品的制备 用病毒RNA提取试剂盒提取粪便样本中的RNA，并反转录成cDNA；以cDNA为模板，使用“1.3”中上、下游引物进行PCR扩增。扩增产物经回收纯化后克隆于pMD18-T载体，构建重组质粒pMD18T-3D，后经PCR和测序鉴定。测序结果与GenBank中相关的核酸序列进行Blast比对分析，将测序正确的重组质粒用超微量分光光度计测定浓度，将浓度换算成拷贝数，作为质粒标准品，放置于-80℃超低温冰箱保存备用。

1.4.2反应条件优化 将反应退火温度设置为56，57，58，59，60和61℃，选择Ct值最小的温度作为最佳退火温度。将上、下游引物终浓度设置为0.1，0.2，0.3，0.4，0.5和0.6 μmol/L，探针终浓度设置为0.05，0.10，0.20，0.25，0.30和0.40 μmol/L进行扩增反应，选择最佳的引物和探针终浓度。

1.4.3标准曲线绘制 将质粒进行10倍梯度稀释，选取102～108拷贝/μL等不同浓度的质粒作为模板，按照“1.4.2”优化后的条件进行PCR扩增，绘制标准曲线。

1.4.4特异性评价 以牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛星状病毒为模板，利用本研究建立的方法进行扩增，以质粒标准品为阳性对照，同时设阴性对照，评价方法的特异性。

1.4.5敏感性评价 以浓度梯度为100～108拷贝/μL的质粒为模板，利用本研究建立的方法和常规PCR进行扩增，对比两种方法的灵敏性。

1.4.6重复性评价 选取104～107拷贝/μL等4个不同浓度的质粒为模板，利用建立的方法分别进行组内和组间扩增，每个样本设3个重复，计算Ct值的标准差和变异系数，评价方法的重复性。

1.5 临床样本的检测利用本研究建立的方法和YAMASHITA等[3]建立的RT-PCR方法检测221份临床样本，比较2种方法对BKoV的检出率。

2 结 果

2.1 质粒标准品的制备重组质粒测序后经BLAST检索，为BKoV的 3D基因片段。经测定，重组质粒的质量浓度为33.28 mg/L，计算得到其拷贝数为1.10×1010拷贝/μL。

2.2 PCR反应体系及条件优化选取浓度为1.10×105拷贝/μL的质粒为模板进行反应体系优化，当引物和探针在反应体系中的终浓度分别为0.2和0.1 μmol/L时，Ct值最小，扩增效率较稳定。反应体系确定为20 μL：2×Premix 10 μL，上下游引物(10 μmol/L)各0.4 μL，探针(10 μmol/L)0.2 μL，模板2 μL，ddH2O 7 μL。反应条件为：95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s并收集荧光信号，共40个循环。

2.3 标准曲线的绘制重组质粒在1.10×102～1.10×108拷贝/μL范围内线性关系良好(图1)，回归方程为y= -3.31x+40.987，R2=0.9998。

图1 BKoV 102～108 拷贝/μL浓度模板标准曲线

2.4 特异性评价以牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒和牛星状病毒的cDNA为模板，质粒标准品为阳性对照，ddH2O为阴性对照，利用本研究建立的方法分别检测。结果显示，仅BKoV有特异性扩增曲线，其他病原及阴性对照无扩增出现(图2)。

2.5 敏感性评价以浓度梯度为1.10×100～1.10×108拷贝/μL的质粒为模板，利用本研究建立的方法进行扩增，结果显示，该方法和常规PCR对BKoV的最低检出限分别为 11.0 拷贝/μL(图3A)和1.10×102拷贝/μL(图3B)，表明该检测方法更灵敏。

1.质粒标准品，1.10×106 拷贝/μL；2～6.牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛星状病毒和ddH2O

1～9.质粒标准品浓度分别为1.10×108～1.10×100 拷贝/μL；10.阴性对照

2.6 重复性评价以1.10×104～1.10×107拷贝/μL等4个浓度的质粒为模板，分别进行组内和组间PCR扩增。结果显示，组内Ct值变异系数为0.26%～0.50%，组间Ct值变异系数为0.71%～1.91%，均在2.0%以下(表2)，表明该检测方法重复性较好。

表2 重复性试验扩增结果

2.7 临床样品的检测本试验所建方法检出BKoV的样品数为20份，检出率为9.05%，YAMASHITA等[3]所建方法检出BKoV阳性样品数17份，检出率为7.69%，本试验所建方法可用于对临床样本的检测(表3)。

表3 临床样品的检测结果

3 讨 论

腹泻是犊牛的常见综合征，可引起犊牛死亡，断奶前犊牛尤为显著[8]，死亡率高达58%[9]，给养牛业带来极大的经济损失。BKoV自2003年被发现以来，一直广受关注，因健康犊牛和腹泻犊牛的粪便中均可检出BKoV，故其是否直接导致犊牛腹泻，目前尚无定论。相关报道指出腹泻犊牛粪便中BKoV的检出率要远远高于健康犊牛粪便中的检出率[2,10-12]，提示BKoV极有可能参与了腹泻的致病和发展进程；且在腹泻犊牛中BKoV作为单一病原被检出[13]，也提示BKoV可能是引起犊牛腹泻的病毒性病原之一。但由于BKoV目前尚无建立成熟的细胞培养模型，加之相关动物试验数据的空白，无法从体内、体外两个方面确定BKoV在犊牛腹泻的病程演变中扮演何种角色，后续BKoV的分离纯化和对其致病性的研究亟需进行。

目前，RT-PCR仍然是各国检测BKoV的主流技术，扩增的靶序列主要为3D[2,11,14-15]、VP1[10,16]、VP0[10]等基因的部分序列或全长；WANG等[4]通过构建核酸文库利用NGS技术从犊牛粪便样本中检测BKoV，并获得IL35164毒株的全基因组序列，但该技术经济成本颇高，且对采样及样品运输等过程要求较高，并不适用于临床大批量样本的检测。另外，迄今为止除日本U-1株成功分离外，尚无其他BKoV毒株成功分离的报道。尽管SAVARD等[13]应用荧光定量探针法检测BKoV，与本研究类似，但前者扩增片段为114 bp，本研究设计引物扩增目的片段仅为60 bp，目的片段较前者更短，扩增反应时间也更短，且前者扩增的靶序列与本研究靶序列核苷酸相似性较低；目前世界范围内已报道的荧光定量探针法检测BKoV的方法仅有前者一种，故本研究建立的BKoV荧光定量检测方法丰富了该研究领域。

尽管BKoV 能否直接引起犊牛腹泻尚无定论，且目前市场上也无有效疫苗对其进行有效防疫，另外临床检测发现BKoV常与其他犊牛腹泻病原如牛冠状病毒、牛轮状病毒、牛病毒性腹泻病毒、牛环曲病毒等[10-11,13]混合感染，加重腹泻的程度。所以及时尽早检测病原，并进行有效净化，仍旧是防控BKoV的主要手段。本研究使用荧光探针对BKoV进行定量检测，其对BKoV的最低检出量为11.0 拷贝/μL，灵敏性高，为BKoV的快速检测和流行情况探查提供了新的实验室手段。