刘 菁，孙吉祥，李 倩，高 英

（新疆维吾尔自治区人民医院临床营养研究所，新疆乌鲁木齐 830001）

黑果小檗（Berheris heteropoda Schrenk） 是小檗科小檗属灌木，在新疆阿尔泰山、天山、巴尔鲁克山及周边蒙古和哈萨克斯坦海拔800～1 200 m 的山中均有分布。根据《新疆植物志》 （1999 年版） 记载，黑果小檗果实成熟后显紫黑色，故得名[1]。研究表明黑果小檗果实含有丰富的花色苷[2]，由于花色苷的抗氧化性、抗癌[3]、防治心血管系统疾病、降血糖[4]、改善大脑功能等作用[5-6]，有关黑果小檗中花色苷引起了人们的研究兴趣。

目前，花色苷提取方法有溶剂直接提取法、超声辅助提取法、微波辅助提取法[7]、酶提取法、回流提取法[8]、超临界CO2提取法等[9]。超声作用可以大幅缩短提取时间[10]，纤维素酶和果胶酶可以有效破坏植物细胞的细胞壁，有利于提取溶剂与目标物质接触[11-12]。以黑果小檗果总花色苷（Berheris heteropoda Schrenk total anthocyanins，BHSTA） 提取率为考查指标，在单因素试验基础上，通过响应面法（Response Surface Method，RSM） 优化了酶- 超声波辅助提取工艺。提取纯化后的花色苷极不稳定，易被氧化[13]，在pH 值、温度、光照等因素作用下，容易降解破坏[14]。试验进一步对温度和pH 值2 个因素对BHSTA的降解作用进行研究，建立BHSTA 热降解动力学模型，以期为充分开发利用黑果小檗果实提供借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

药材黑果小檗果实于2019 年9 月采自新疆乌鲁木齐市南山山区。晾干后，仔细筛选，丢弃已破损、腐败果实，挑选饱满优良的黑果小檗干果，去除果茎及种子。用药材粉碎机将果皮粉碎、过20 目筛，置于-20 ℃冰箱中避光存放。

果胶酶，上海如吉生物科技发展有限公司提供；无水乙醇，天津永晟精细化工有限公司提供；盐酸、氢氧化钠、氯化钾、乙酸钠，国药集团化学试剂有限公司提供，均为分析纯。

1.2 仪器与设备

WV-754 型紫外可见分光光度计，上海菁华科技仪器有限公司产品；AS10200AD 型超声波清洗机，天津奥特赛恩仪器有限公司产品；TGL-16M 型台式高速冷冻离心机，上海卢湘仪离心机仪器有限公司产品；SCIENTZ-10ND 型冷冻干燥机，宁波新芝生物科技股份有限公司产品；RE-53A 型旋转蒸发器，上海亚荣生化仪器厂产品；SHB-4 循环水多用真空泵，宁波杜甫仪器厂产品；PHS-26 型数显pH 计，上海精密试验仪器有限公司产品；HHS 型电热恒温水浴锅，北京博迅实业有限公司医疗设备厂产品。

1.3 试验方法

1.3.1 花色苷含量测定

应用pH 示差法测定BHSTA 的含量[15]。配置pH 值1.0 缓冲液、pH 值4.5 缓冲液，备用。吸取待测BHSTA 提取液2 mL 至离心管中，以转速3 000 r/min 离心5 min。精密量取0.5 mL 上清液至10 mL 棕色容量瓶中，平行2 份，分别用pH 值1.0 缓冲液、pH 值4.5缓冲液定容至刻度，放置10 min 后于波长517 nm 和700 nm 处测定吸光度。结果以每1 g 果实含相当于矢车菊素-3-O-糖苷（Cy-3G） 的含量计算，计算公式（1）、（2） 表示：

式中：

MW——矢车菊素-3-糖苷分子量（449.2 g/mol）；

ε——矢车菊素-3-O-糖苷摩尔消光系数（26 900 L/(cm·mol）；

DF——稀释倍数；

L——吸收池厚度（1 cm）；

V——提取体积，mL；

m——果皮粉末质量，g。

1.3.2 单因素试验

（1） pH 值对提取率的影响。称取果实粉末2.0 g，以80%乙醇为溶剂，固定料液比1∶30（g∶mL），提取温度40 ℃，提取时间40 min 和酶添加量1.0%条件下，探讨pH 值2，3，4，5，6 对花色苷提取率的影响，确定最合适提取pH 值。

（2） 温度对提取率的影响。称取黑果小檗果实粉末2.0 g，以80%乙醇为溶剂，固定料液比1∶30（g∶mL），酶解pH 值2，提取时间40 min 和酶添加量1.0%条件下，探讨提取温度30，40，50，60，70 ℃对花色苷提取率的影响，确定最合适提取温度。

（3） 提取时间对提取率的影响。取黑果小檗果实粉末2.0 g，以80%乙醇为溶剂，固定料液比1∶30（g∶mL），酶解pH 值2，提取温度40 ℃和酶添加量1.0%条件下，探讨提取时间10，20，30，40，50 min 对花色苷提取率的影响，确定最合适提取时间。

（4） 酶添加量对提取率的影响。取黑果小檗果实粉末2.0 g，以80%乙醇为溶剂，固定料液比1∶30（g∶mL），酶解pH 值2 和提取温度40 ℃条件下，探讨酶添加量1.0%，1.5%，2.0%，2.5%，3.0%对花色苷提取率的影响，确定最合适酶添加量。

1.3.3 响应面优化试验

在单因素试验结果的基础上，以酶解pH 值、酶解温度、酶添加量为观察变量，采用Box-behnken试验设计方案，进行三因素三水平的工艺条件优化。

响应面（RSA） 试验因素与水平设计见表1。

表1 响应面（RSA） 试验因素与水平设计

1.3.4 BHSTA 降解动力学研究

（1） BHSTA 的提取。按照响应面法得到的最佳提取工艺，称取一定量的黑果小檗果实粉末，置避光锥形瓶中，室温超声提取3 次，过滤后合并滤液，38 ℃下旋蒸得到浓缩液，置于-20 ℃冰箱中低温避光储存，备用。

（2） BHSTA 的纯化。选用XDA-7A 型大孔树脂分离纯化BHSTA[16]，层析柱径长比1∶8，上样流速调整到2 mL/min，上样后静置过夜，采用盐酸酸化的纯化水冲洗10 h，流速控制在1.5～2.0 mL/min。洗脱液为盐酸酸化的50%乙醇溶液，pH 值为1.0，洗脱液用量为6 BV。洗脱液在40 ℃减压旋蒸出乙醇溶剂得BHSTA 浓缩液，于-80 ℃下冻干后得到BHSTA 冻干粉，全程注意避光。

（3） 不同pH 值的BHSTA 的配制。提前用2 mol/L HCl 和2 mol/L NaOH 溶液配置pH 值分别为1.0，2.0，3.0，4.0，5.0，6.0 的溶液。称取相同量的BHSTA冻干粉，用相同体积的不同pH 值溶液溶解，备用。

（4） pH 值和温度对BHSTA 降解的影响。分别吸取不同pH 值的BHSTA 溶液装入EP 管内封口，pH 值的溶液平行5 份，放入不同温度（60，70，80，90 ℃） 水浴中避光加热8 h。过程中每1 h 间隔取出1 个样品，放入冰水中快速降温，采用1.3.1 方法测定浓度。分别计算一级动力学反应的速率常数（k）、降解半衰期（t1/2）、并采用Arrhenius 方程计算活化能Ea，相关公式如（3） ～（5） 表示：

式中：

C——花色苷终质量浓度，mg/L；

C0——花色苷初始质量浓度，mg/L；

k——热降解反应常数，h-1；

k0——频率常数，h-1；

R——气体常数8.314 J/(mol·K)；

T——反应温度，K；

Ea— —活化能，kJ/mol；

1.4 数据处理

试验均重复3 次。采用Excel 软件进行数据整理和统计分析，同时采用Graphpad prism 7.0 绘图软件作图，采用Design Expert 8.0.6 软件进行响应面分析处理。

2 结果与分析

2.1 提取条件优化

2.1.1 单因素试验

各影响因素对BHSTA 提取率的影响见图1。

图1 各影响因素对BHSTA 提取率的影响

由图1（a） 可知，在果胶酶的催化作用下，pH值为2～3 时，BHSTA 的提取率随着pH 值上升而提高，当pH 值为3 时提取率为0.97%。pH 值继续提高则BHSTA 的提取率下降，初步选取pH 值3 为最适宜值。由图1（b） 可知，提取温度50 ℃时BHSTA 的提取率为1.19%，初步选取50 ℃为最适宜温度。由图1（c） 可知，果胶酶存在时提取30 min，总花色苷的提取率为1.26%。延长提取时间并不再显著改善提取率，反而有下降趋势，初步选取30 min为最适宜时间。由图1（d） 可知，BHSTA 提取率随酶用量的增加呈上升后下降的趋势，当酶添加量为2%，BHSTA 的提取率最高，为1.35%。初步选取1.35%为最适宜酶添加量。

2.1.2 响应面结果与分析

依据单因素试验确定的最适宜参数，以pH 值、温度、酶添加量为观察因素，采用三因素三水平响应面试验进一步优化提取工艺。

响应面试验设计和试验结果见表2，响应面方差分析二次模型方差分析见表3。

表2 响应面试验设计和试验结果

多参数的回归方程如公式（6）：

由表3 可知，响应面回归模型显著性极佳（p＜0.000 1），失拟项不显著（p=0.079 5），回归模型决定系数0.996 9，该模型能解释99.69%变化。模型拟合度较好，该模型对酶-超声辅助BHSTA 提取工艺的参数优化稳定性较好。模型中一次项A，B，C 参数有统计学意义（p＜0.000 1），二次项A2，B2，C2参数有统计学意义（p＜0.05），交叉项AB 参数有统计学意义（p＜0.05），BC，CD 参数无统计学意义（p＞0.05）。对一次项A，B，C 的F 值分析，确定参数对BHSTA 提取率的影响大小依次为温度＞酶添加量＞pH 值。

表3 响应面方差分析二次模型方差分析

2.1.3 交互效应分析

各因素交互作用的响应面图和等高线图见图2。

图2 各因素交互作用的响应面图和等高线图

依据建立的回归方程得到对应的等高线及曲面图，进一步分析交互作用对提取率的影响。由图2可知，A 与B 的交互作用响应面图中，曲度较为陡峭，交互作用明显，等高线呈现椭圆状，亦显示交互作用明显，结论与回归方程方差分析结果相同。而A，C 响应曲面坡度较为平缓，B，C 的响应曲面坡度虽可见陡峭，但二者的等高线均趋向圆形，可见交互作用不明显。

2.1.4 最佳提取条件的确定和验证

通过对回归模型分析得出BHSTA 提取的最佳工艺参数为pH 值3.95，酶解温度52.68 ℃，酶添加量2.33%；得到BHSTA 提取率预测值为1.37%；再以以上参数进行最优工艺验证，试验平行进行3 次，得到BHSTA 提取率为1.35%，与预测值相近。该工艺参数具有一定的准确性和可靠性。

低温是提取和纯化花色苷的必要条件[17]。采用酶-超声辅助提取法BHSTA 在低温下获得较高的提取率。由于超声的高能量，使得分子运动加速，冲击频率增加，导致细胞壁的通透性增加，溶剂更容易与花色苷分子接触[18]，提取时间大幅减少，且操作方法简单、成本低廉[19]。酶能促进细胞壁的解体，促进目标物质的释放，适宜的温度可以维持酶的活性，也可以维持花色苷的稳定性。超声与酶助提取的联合应用，可以达到更高目标收率。虽然酶有利于目标物质的提取，但酶的作用并不总是积极的[20]。当酶用量达到一定水平时，进一步增加可能会降低目标物的提取率[21]，同时酶受到变性和引入新杂质的限制[22]。

2.2 BHSTA 热降解动力学

2.2.1 不同pH 值和温度下BHSTA 的热降解参数

BHSTA 在不同温度和pH 值条件下的降解见图3，不同pH 值下的BHSTA 热降解参数见表4。

图3 BHSTA 在不同温度和pH 值条件下的降解

表4 不同pH 值下的BHSTA 热降解参数

图3 显示了pH 值为1.0～5.0 和温度为50～80 ℃条件下BHSTA 降解规律。不同温度条件下，ln(C/C0)与时间变化符合线性规律（R2＞0.99），说明BHSTA降解符合一级反应动力学规律，与其他文献记载的花色苷降解规律相一致。在研究的pH 值范围内，BHSTA 的热降解速率与温度呈正相关，表现为热降解反应常数K 的增大和半衰期t1/2的变小。pH 值为1.0～5.0 时，温度越高，随着时间延长，花色苷含量下降越快，表明花色苷降解速率越快。活化能Ea是体系稳定性的一个重要指标，pH 值1.0～5.0 体系中，Ea在pH 值1.0 时最高，此时需要更多的能量来降解，BHSTA 最为稳定。在pH 值5.0 时最低，此时需要较少的能量，反应较易进行，降解较快，BHSTA热稳定性最差。

2.2.2 温度和pH 值对BHSTA 一级降解动力学的影响

温度、pH 值对BHSTA 一级降解动力学的影响见图4。

图4 温度、pH 值对BHSTA 一级降解动力学的影响

由图4（a） ～（b） 可知，pH 值相同时，随着温度的升高，反应速率常数k 的升高呈指数型加快的特点，半衰期t1/2则呈指数减小的特点。随着体系pH值增大，反应速率常数随温度升高而增长速度在加快，曲线更加陡峭，半衰期随温度升高快速变小，趋于同一水平。由图4（c） ～（d） 可知，相同的温度时，随着pH 值的增大，反应速率常数k 的升高呈指数型加快的特点，半衰期t1/2则呈指数型减小的特点。反应速率常数随pH 值升高而增长速度在加快，曲线更加陡峭，半衰期随温度升高快速变小，趋于同一水平。

温度是BHSTA 最为重要的影响因素。其机制为花色苷首先发生水解或去糖基开环反应，然后形成查耳酮或其同分异构体α -二酮，最后降解为酚酸和醛类[23]。有研究表明，花色苷的结构变化过程中，花色苷的二苯基苯并吡喃阳离子（AH+） 的失电子过程AH+→A 是放热过程，水解反应AH+→B（甲醇假碱） 和开环反应B→C（查尔酮） 是吸热反应，并且向着熵增大方向进行。温度升高时，平衡向着无色的甲醇假碱和查尔酮形式转化，热降解速率加快[24]。

pH 值亦对BHSTA 稳定性尤为重要。当介质的pH 值不同时，花色苷的分子结构也以不同形式存在。当pH 值＜2.0 时显红色，主要以2-苯基苯并吡喃阳离子（AH+） 的形式存在；当pH 值为4～5 时，颜色逐渐由红色变为蓝色，此时花色苷存在形式为醌型碱（B）。可能的机制是在pH 值2.0～4.0 的介质中，花色苷的C3 糖苷率先发生水解，苷元进一步通过水合反应生成花色素的假碱形式，最后通过异构化产生查尔酮及其同分异构体α -二酮。由于产物中依然有查尔酮糖苷，一种解释可能是花色苷先生成假碱葡萄糖苷，再通过开环反应生成查尔酮糖苷[25]。查尔酮糖苷进一步脱去糖苷成为查尔酮和其同分异构体α -二酮，最终降解为酚酸和醛类。

3 结论

在单因素试验基础上，应用响应面分析法对BHSTA 的酶-超声波辅助提取工艺进行了优化。最终建立了回归方程，得到了BHSTA 的最适合提取工艺参数为酶解pH 值3.95，酶解温度52.68 ℃，酶添加量2.33%，可使BHSTA 的提取率达到1.37%。BHSTA 的降解符合一级反应动力学规律，温度和pH值2 个因素都是BHSTA 稳定性的重要影响因素，酸性环境和低温条件下，热稳定性较好。