张聪聪， 刘瀚泽， 王永丽， 张定棋， 陈佳美， 刘 伟*， 刘 平， 王长虹*

(1.上海中医药大学中药研究所，中药标准化教育部重点实验室，上海市复方中药重点实验室，上海 201203；2.上海中医药大学附属曙光医院肝病研究所，肝肾疾病病证教育部重点实验室，上海市中医临床重点实验室，上海 201203)

大黄为蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.、唐古特大黄RheumtanguticumMaxim. ex Balf.或药用大黄RheumofficinaleBaill.的干燥根和根茎，具有泻下攻积、清热泻火、凉血解毒、逐瘀通经、利湿退黄的功效[1]，其主要化学成分包括蒽苷、二苯乙烯、有机酸、鞣质[2-3]。桃仁为蔷薇科植物桃Prunuspersica(L.) Batsch或山桃Prunusdavidiana(Carr.) Franch.的干燥成熟种子，具有活血祛瘀、润肠通便、止咳平喘的功效[1]，化学成分主要有苦杏仁苷、脂肪酸、蛋白质、甾醇及其糖苷、黄酮、酚酸等[4]。大黄-桃仁药对是临床常用的破瘀药对，两者配比主要为5∶1～4∶1，共136首，占比95.8%[5]，功效活血祛瘀、消痈解毒、泄热通便、温阳散寒、健脾养胃、舒筋活血，其中主活血祛瘀的药对有58首，占比40.8%[6]。现代研究表明，大黄-桃仁药对具有抗炎、改善微循环、调节免疫、抗肿瘤、抗肝纤维化、抗术后粘连性肠梗阻等药理作用[7-8]。

药对是中药配伍应用的重要模式，由于其组成相对简单，疗效及物质基础更容易被解析，因而相关研究已成为阐释中医药治疗复杂性疾病科学理论及指导其新药研发的重要突破口之一[9]。中药配伍使用后产生助溶、沉淀、化学反应等现象，有效成分溶出率发生变化，这并非单味药“数”“量”上的简单相加，对临床疗效也可产生影响[10]。文献[11-14]报道，桃仁中含有苦杏仁苷酶，可水解苦杏仁苷等糖苷类成分，对大黄中的蒽醌苷类成分也可能具有水解作用。本实验建立UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS法同时测定大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、番泻苷A、番泻苷B、儿茶素、没食子酸、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、1,8-二羟基蒽醌、苦杏仁苷、野黑樱苷含量，考察大黄-桃仁药对不同比例配伍水煎液中其变化，以期探索不同配伍方式及配伍比例对主要成分溶出的影响，也为该药对配伍的物质基础研究提供实验数据。

1 材料

1.1 仪器 Q Exactive 四极杆/静电场轨道阱高分辨质谱仪(美国Thermo Fisher Scientific公司)；Acquity UPLC®BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm，美国Waters 公司)；Milli-Q超纯水处理系统，美国 Milli-pore公司；YH系列电热器(500 mL，江苏近湖镇教学仪器厂)；DK-8D型恒温水浴锅(上海一恒科技有限公司)；BP211D电子分析天平(十万分之一，德国Sartorius公司)。

1.2 药物与试剂 大黄(批号20200504)、桃仁(批号20190824)经上海中医药大学中药研究所王长虹研究员鉴定分别为蓼科植物掌叶大黄RheumpalmatumL.的根茎、蔷薇科植物山桃Prunusdavidiana(Carr.) Franch.的干燥成熟种子。大黄素(批号J0610AS)、芦荟大黄素(批号N1126AS)、番泻苷A(批号00912AS)、番泻苷B(批号J0603AS)、儿茶素(批号M0706AS)、没食子酸(批号D0409AS)对照品均购于大连美仑生物技术有限公司；大黄酸(批号PRF7080541)、大黄素-8-O-葡萄糖苷(批号PRF8082225)、大黄素-1-O-葡萄糖苷(批号PRF8060621)、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷(批号PRF8081202)、大黄酸-8-O-葡萄糖苷(批号PRF8102402)、大黄酚-1-O-葡萄糖苷(货号PRF9040201)、大黄酚-8-O-葡萄糖苷(批号PRF9072024)对照品均购于成都普瑞法科技开发有限公司；1,8-二羟基蒽醌(批号HO1017YA14)、野黑樱苷(批号X06D9L77005)、苦杏仁苷(批号M0905AS)对照品均购于上海源叶生物科技有限公司，纯度均大于99%。甲醇、乙腈、甲酸为色谱纯(美国Thermo Fisher Scientific公司)；水为超纯水，由Milli-Q超纯水系统制得。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 Dionex Ultimate 3000高压液相系统，Acquity UPLC® BEH C18色谱柱(100 mm×2.1 mm，1.7 μm)；流动相0.1%甲酸-乙腈，梯度洗脱(0～0.5 min，10%乙腈；0.5～5 min，10%～33%乙腈；5～11.5 min，33%～90%乙腈；11.5～13.5 min，90%乙腈；13.51～15 min，10%乙腈)；体积流量0.4 mL/min；柱温40 ℃；进样量2 μL。

2.2 质谱条件 Q Exactive四极杆-静电场轨道阱高分辨质谱仪；电喷雾离子源(H-ESI)，辅助气流量13 arb；辅助加热器温度300 ℃；离子传输管温度320 ℃；自动增益控制(AGC)106，s-lens射频水平50；正离子模式鞘气(N2)流量35 arb，喷雾电压3.5 kV；负离子模式鞘气(N2)流量35 arb，喷雾电压2.5 kV；负离子Full MS-SIM模式，扫描范围m/z100～1 500。其他主要参数见表1，总离子流图见图1。

表1 各成分质谱参数Tab.1 Mass spectrometry parameters for various constituents

2.3 对照品溶液制备 取16种对照品适量，精密称定，甲醇制成质量浓度为1.0 mg/mL的贮备液，精密量取适量，甲醇稀释，制成没食子酸、儿茶素、苦杏仁苷、野黑樱苷质量浓度为20.0 μg/mL，其他12种成分质量浓度为50.0 μg/mL的溶液，即得。

2.4 供试品溶液制备

2.4.1 单煎液和不同配比大黄桃仁煎煮液 将大黄、桃仁粉碎成粗粉，分为大黄单煎组(大黄1 g，桃仁0 g)、大黄-桃仁5∶1组(大黄0.833 g，桃仁0.167 g)、大黄-桃仁4∶1组(大黄0.8 g，桃仁0.2 g)、大黄-桃仁2∶1组(大黄0.67 g，桃仁0.33 g)、大黄-桃仁1∶1组(大黄0.5 g，桃仁0.5 g)、大黄-桃仁1∶2组(大黄0.33 g，桃仁0.67 g)、大黄-桃仁1∶4组(大黄0.2 g，桃仁0.8 g)、大黄-桃仁1∶5组(大黄0.167 g，桃仁0.833 g)、桃仁单煎组(大黄0 g，桃仁1 g)，采用冷凝回流法，加入10倍量水煎煮30 min，滤过，药渣再加入10倍量水煎煮30 min后过滤，合并2次滤液，纯水定容至50 mL量瓶中，平行3份，20%甲醇稀释10倍，0.21 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.4.2 大黄桃仁温浸液 取大黄、桃仁粗粉，分为大黄单药组、大黄-桃仁(1∶1)药对组、桃仁单药组，置于100 mL锥形瓶中，分别加入1 g大黄、1 g大黄+1 g桃仁、1 g桃仁，加入50 mL水，置于50 ℃水浴锅中温育，平行3份，分别在5 min、20 min、1 h、3 h、6 h、10 h、24 h摇匀后取100 μL，立即加到400 μL乙腈中，混匀，20%甲醇稀释20倍，0.21 μm微孔滤膜过滤，即得。

2.5 线性关系考察 精密量取“2.3”项下贮备液适量，20%甲醇稀释并定容，依次配制成8个质量浓度，其中没食子酸、儿茶素、苦杏仁苷、野黑樱苷分别为1.31、3.28、8.19、20.48、51.20、128.00、320.00、800.00 ng/mL，大黄素、大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、番泻苷A、番泻苷B、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、1,8-二羟基蒽醌分别为3.28、8.19、20.48、51.20、128.00、320.00、800.00、2 000.00 ng/mL，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定。以对照品质量浓度为横坐标(X)，峰面积为纵坐标(Y)进行回归，以信噪比(S/N)>10计算最低定量限(LLOQ)，结果见表2，可知各成分在各自范围内线性关系良好。

表2 各成分线性关系Tab.2 Linear relationships of various constituents

2.6 精密度试验 制备没食子酸、儿茶素、苦杏仁苷、野黑樱苷、大黄素质量浓度为1.31 ng/mL，大黄酸、芦荟大黄素、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、番泻苷A、番泻苷B、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷、1,8-二羟基蒽醌质量浓度为3.28 ng/mL的对照品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定6次，测得各成分峰面积RSD为2.07%～8.75%，表明仪器精密度良好。

2.7 重复性试验 按“2.4.1”项下方法平行制备6份大黄-桃仁(1∶1)煎煮液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得各成分含量RSD为1.10%～6.93%，表明该方法重复性良好。

2.8 稳定性试验 取3份“2.4.1”项下大黄-桃仁(1∶1)煎煮液，室温(25 ℃)下于0、4、8、12、24 h在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得各成分含量RSD为1.58%～2.88%，表明溶液在24 h内稳定性良好。

2.9 加样回收率试验 按“2.4.1”项下方法平行制备9份大黄-桃仁(1∶1)煎煮液，每3份为1组，加入对照品溶液适量，使加入后各成分含量分别为大黄-桃仁(1∶1)煎煮液中相应成分含量的50%、100%、150%。结果，各成分加样回收率为95.38%～104.90%，RSD为1.06%～7.58%。

2.10 含量测定

2.10.1 单煎液和不同配比大黄桃仁煎煮液中 按“2.4.1”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，计算含量，结果见表3～4,可知单煎液和大黄桃仁不同配比情况下的水煎液中其溶出率具有明显差别。随着大黄配伍比例的减少，大黄中儿茶素、番泻苷B、番泻苷A、芦荟大黄素、大黄酸、大黄素、1，8-二羟基蒽醌溶出量整体具有增加的趋势；没食子酸溶出量整体上具有减少的趋势；芦荟大黄素-8-葡萄糖苷、大黄酸-8-葡萄糖苷、大黄素-8-葡萄糖苷溶出量具有先增加后降低的趋势，大黄-桃仁1∶1时溶出率最高；大黄素-1-葡萄糖苷、大黄酚-1-葡萄糖苷、大黄酚-8-葡萄糖苷溶出量也具有先增加后降低的趋势，大黄-桃仁1∶4时溶出率最高。随着桃仁配伍比例的增加，桃仁中苦杏仁苷、野黑樱苷溶出率具有先增加后降低的趋势，其中苦杏仁苷在大黄-桃仁4∶1时溶出率最高，野黑樱苷在2∶1时溶出率最高。

表3 单煎液和大黄桃仁药对不同配比下煎煮16种待测成分溶出测定结果Tab.3 Dissolution results of sixteen target analytes in decoctions of single herband drug pairs with different proportions of R. palmatum and P.

表4显示，大黄-桃仁4∶1时16种成分总溶出量最高，1∶4时最低；来源于桃仁的成分溶出量随着桃仁占比增加具有先增加后降低的趋势，在大黄-桃仁4∶1时最高；来源于大黄的成分溶出量随着大黄占比减少具有增加趋势，在大黄-桃仁1∶2～1∶5时较高，1∶2时最高；大黄鞣酸、蒽醌类成分溶出量随着大黄占比减少整体具有增加趋势，其中鞣酸类成分在大黄-桃仁1∶2时最高，蒽醌类成分在1∶5时最高；大黄蒽醌苷类成分溶出量随着大黄占比减少整体具有先增加后降低趋势，在大黄-桃仁1∶4时最高；大黄蒽醌苷元类成分溶出量随着大黄占比减少整体具有增加趋势，在大黄-桃仁1∶5时最高。

表4 单煎液和大黄桃仁药对不同配比下煎煮各类成分含量Tab.4 Contents of various constituents in single decoction and different proportions of R. palmatum and P. davidiana

2.10.2 不同时间大黄桃仁温浸液中 按“2.4.2”项下方法制备供试品溶液，在“2.1”“2.2”项条件下进样测定，测得大黄单药组、大黄-桃仁(1∶1)药对组、桃仁单药组在50 ℃温育不同时间后16种成分的含量，结果见图2。由此可知，在温浸条件下桃仁单药组仅在5、20 min温浸液中检测到少量苦杏仁苷和野黑樱苷，大黄-桃仁(1∶1)药对组温浸液中5 min时可以检测到较高含量的两者，随着温浸时间延长含量迅速下降，3 h以后低于定量限；对大黄单药组与大黄-桃仁(1∶1)药对组成分含量进行比较，发现不同时间点2组温浸液中没食子酸、番泻苷B、番泻苷A、大黄素无明显差异；但其他10种成分差异明显，其中芦荟大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酸-8-O-葡萄糖苷、大黄素-1-O-葡萄糖苷、大黄酚-1-O-葡萄糖苷、大黄素-8-O-葡萄糖苷、大黄酚-8-O-葡萄糖苷在大黄单药组中显著高于药对组中，儿茶素、芦荟大黄素、1,8-二羟基蒽醌、大黄酸恰好相反。

注：△为大黄单药组组，□为大黄-桃仁(1∶1)药对组，○为桃仁单药组。图2 不同温浸时间对大黄桃仁药对中16种成分溶出的影响Fig.2 Effects of different immersion time on the dissolution of sixteen target analytes in immersion of R. palmatum and P. davidiana drug pair

3 讨论

本研究建立了同时测定大黄-桃仁药对中16种成分含量的UHPLC-Q-Exactive Orbitrap HRMS法，发现它们在单煎液和不同配比大黄-桃仁药对水煎液中的溶出具有明显差别，可能与煎煮加热升温过程中桃仁中的β-葡萄糖苷酶水解糖苷类成分有关。参照文献[14]，验证桃仁中β-葡萄糖苷酶可水解大黄和桃仁中的糖苷类成分，它是在桃仁、苦杏仁[14]、桔梗[15]、天麻[16]等中药中普遍存在的一种水解酶，提示使用相关药味时需要关注酶对糖苷类成分的影响。近年来，肠道菌群与中药成分之间的相互作用备受关注，前者有许多细菌含有丰富的糖苷水解酶基因，能产生糖苷水解酶[17]，还含有许多其他类型的酶(氧化酶、还原酶、酯酶等)，可进行广泛的药物代谢。大黄、桃仁均含有大量糖苷类成分，如大黄中的结合性蒽醌苷类成分能在肠道菌作用下转化成游离蒽醌，可能导致其活性或毒性发生改变，而番泻苷A等成分可调节肠道菌的组成与肠道代谢物，提示大黄与肠道菌之间存在特殊的相互作用[18-19]；桃仁中的苦杏仁苷能在肠道菌作用下水解为野黑樱苷、扁桃腈，再分解成毒性较强的氢氰酸。

本实验建立的方法与目前报道的HPLC法[20-23]相比，不需要待测物完全基线分离及UHPLC/UFLC[24]，因而检测时间大大缩短，但液质仪器较为昂贵，成本也有所增加；基于四极杆-静电场轨道阱技术的高分辨质谱系统进行定量研究，是利用其高分辨的功能特点，采用一级质谱精确定量，并在保证极高的稳定性和准确度同时简化了操作流程，节省了分析时间，可为大黄-桃仁药对配伍物质基础的进一步研究提供科学、稳定、可靠的技术支持。