余 敏,崔 跃,黎鹏飞,谢 丹,陈 芬(武汉市红十字会医院心血管内科,武汉 43005;华中科技大学同济医学院附属协和医院心内科;通讯作者,E-mail:54887500@qq.com)

糖尿病会引起心肌病,并增加心脏衰竭的风险,而与高血压和冠心病无关,这被称为“糖尿病性心肌病”[1]。该病的发病机制是多因素的,普遍认为胰岛素抵抗和高血糖症是糖尿病性心肌病主要的促发因素[2]。糖尿病性心肌病对受影响的患者产生不利的预后影响,目前尚无目标疗法。大黄素(1,3,8-三羟基-6-甲基-9,10-蒽二酮,C15H10O5)是从一些传统中草药(包括大黄和虎杖)中分离出来的一种蒽醌成分。据报道,大黄素通过上调高糖处理小鼠足细胞中的miR-29a-5p靶向MDM2,缓解足细胞的凋亡[3]。大黄素通过上调miR-138表达保护H9C2细胞免受缺氧损伤[4]。然而,关于大黄素在糖尿病性心肌病中的作用的研究仍然有限。多种微小RNA(microRNA,miRNA)可以介导大黄素的功效,例如miR-199a[5]、miR-1271[6]和miR-145[7]。miR-1224是已鉴定的miRNA,据报道,Kim等[8]通过miRNA表达谱分析发现,miR-1224在高血清C-反应蛋白与心肌缺血再灌注损伤的大鼠心肌中高表达。miR-1224的下调通过调节肝细胞生长因子来预防氧化应激诱导的急性肝损伤[9]。但尚不清楚大黄素是否通过调节miR-1224的表达并影响高糖诱导的心肌细胞损伤。因此,我们的研究旨在探索大黄素对高糖处理的大鼠心肌细胞H9C2凋亡和炎症的影响,并研究大黄素调节miR-1224的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

大黄素(20 mg;含量≥96.0%;中国食品药品检定研究院),大鼠心肌细胞H9C2(美国典型培养物保藏中心),miR-1224 mimic、阴性对照miR-NC(GenePharma),白细胞介素(interleukin,IL)-6酶联免疫吸附测定法(enzyme-linked immunosorbent assay,ELISA)试剂盒、IL-1β ELISA试剂盒、肿瘤坏死因子-α(TNF-α)ELISA试剂盒、RIPA裂解缓冲液(英国Abcam公司),膜联蛋白Ⅴ(Annexin Ⅴ)-异硫氰酸荧光素(fluorescein isothiocyanate,FITC)/碘化丙锭(propidium iodide,PI)细胞凋亡检测试剂盒(北京Biosea公司),BCA蛋白测定试剂盒(上海Sangon Biotech)。

1.2 细胞培养

H9C2细胞(1×104细胞/ml)接种到含10%(V/V)胎牛血清、100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素的Dulbecco改良Eagle培养基(DMEM)的烧瓶中,并于37 ℃、95%空气和5%CO2的潮湿条件下孵育。

1.3 实验分组

为研究大黄素作用,H9C2细胞分为对照组、模型组、低剂量大黄素组、中剂量大黄素组、高剂量大黄素组。对照组以5.5 mmol/L葡萄糖处理,模型组以30 mmol/L葡萄糖培养72 h[10],低、中、高剂量大黄素组分别以5,10,15 μmol/L大黄素[4]+30 mmol/L葡萄糖培养72 h。其中,大黄素以100 mmol/L的浓度溶于二甲基亚砜中,并制成5,10,15 μmol/L浓度备用。

为探讨大黄素的作用机制,H9C2细胞分为高剂量大黄素+miR-NC组、高剂量大黄素+miR-1224组。高剂量大黄素+miR-NC组以15 μmol/L大黄素+30 mmol/L葡萄糖+转染miR-NC培养72 h,高剂量大黄素+miR-1224组以15 μmol/L大黄素+30 mmol/L葡萄糖+转染miR-1224 mimic培养72 h。H9C2细胞转染时,依照Lipofectamine 2000制造商的说明步骤进行,将24孔板中2×104细胞用指定的miR-1224 mimic和miR-NC(50 nmol/L)转染。转染后4-6 h,将转染培养基替换为含15 μmol/L大黄素和30 mmol/L葡萄糖的新鲜培养基,72 h后收集H9C2细胞用于后续测定。

1.4 流式细胞术检测细胞凋亡

收集大黄素作用实验和机制实验分组H9C2细胞,添加适量的新鲜胰蛋白酶进行消化。当细胞开始变圆时,加入等量的10%胎牛血清终止胰蛋白酶消化,在4 ℃和500 r/min下离心5 min。然后加入1 ml预冷的磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline,PBS)悬浮细胞沉淀,并将悬浮液在4 ℃和500 r/min下离心5 min。离心和悬浮3次后,将H9C2细胞悬浮在结合缓冲液(500 μl)中,加入Annexin Ⅴ-FITC(5 μl)和PI(5 μl)染色液。H9C2细胞悬浮室温下放置15 min后,在1 h内进行流式细胞术分析。

1.5 免疫印迹实验检测蛋白表达

收集大黄素作用实验和机制实验分组H9C2细胞,使用RIPA裂解缓冲液从H9C2细胞中提取总蛋白,并通过BCA蛋白测定试剂盒测量蛋白浓度。等量的蛋白质通过10% SDS/PAGE凝胶分离,并转移到PVDF膜上。将膜与一抗在4 ℃下孵育过夜。使用的抗体如下:GAPDH(1 ∶5 000),B细胞淋巴瘤/白血病-2(B cell lymphoma/leukemia-2,Bcl-2,1 ∶3 000)和Bcl-2相关X蛋白(Bcl-2 associated X protein,Bax,1 ∶3 000)。然后在室温下使用相应的二抗孵育1 h。蛋白条带使用增强的化学发光液显像。通过使用Image J软件和GAPDH作为内部参照,通过密度分析定量蛋白表达的水平。

1.6 ELISA法检测IL-6、IL-1β和TNF-α水平

收集大黄素作用实验和机制实验分组H9C2细胞,使用IL-6、IL-1β和TNF-α ELISA试剂盒确定H9C2细胞上清液中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。在Wellscan MK3酶标仪中检测到吸光度OD450值。根据标准品的吸光度值建立标准曲线,并根据标准曲线确定各组H9C2细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平。

1.7 逆转录定量聚合酶链反应(reverse transcription-quantitative polymerase chain reaction,RT-qPCR)检测miR-1224表达

根据Invitrogen制造的TRIzol试剂的指示,从H9C2细胞中提取总RNA。随后,使用TaKaRa反转录试剂盒对提取的RNA进行反转录。根据TaKaRa实时PCR试剂盒进行PCR检测。U6用作内部对照,2-ΔΔCt方法计算miR-1224的相对表达。本研究使用的引物序列如下。miR-1224 F:5′-GCCTGTGACCATCATCCACTG-3′,miR-1224 R:5′-GGATTAAGTGACGAGGCTCAG-3′;U6 F:5′-GCTTCGGCAGCACATATACTAAAAT-3′,U6 R:5′-CGCTTCAGAATTTGCGTGTCAT-3′。

1.8 统计学分析

2 结果

2.1 大黄素对高糖处理H9C2细胞凋亡的影响

与对照组比较,模型组、低剂量大黄素组、中剂量大黄素组和高剂量大黄素组高糖处理H9C2细胞的凋亡率升高,Bcl-2蛋白表达水平降低,Bax蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,低剂量大黄素组、中剂量大黄素组、高剂量大黄素组细胞凋亡率逐渐降低,Bcl-2蛋白表达水平逐渐升高,Bax蛋白表达水平逐渐降低,且低剂量大黄素组与模型组之间差异无统计学意义(P>0.05),中剂量大黄素组、高剂量大黄素组与模型组之间差异有统计学意义(P<0.05)。与低剂量大黄素组相比,中剂量大黄素组和高剂量大黄素组H9C2细胞的凋亡率均降低,Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与中剂量大黄素组相比,高剂量大黄素组H9C2细胞的凋亡率均降低,Bcl-2蛋白表达水平升高,Bax蛋白表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05,见图1,2)。

与对照组相比,*P<0.05;与模型组相比,#P<0.05;与低剂量大黄素组相比,&P<0.05;与中剂量大黄素组相比,△P<0.05图1 大黄素对高糖处理H9C2细胞凋亡率的影响Figure 1 Effect of emodin on cell apoptosis rate of H9C2 treated with high glucose

与对照组相比,*P<0.05;与模型组相比,#P<0.05;与低剂量大黄素组相比,&P<0.05;与中剂量大黄素组相比,△P<0.05图2 大黄素对高糖处理H9C2细胞中Bcl-2、Bax表达的影响Figure 2 Effect of emodin on the expression of Bcl-2 and Bax in H9C2 cells treated with high glucose

2.2 大黄素对高糖处理H9C2细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的影响

与对照组比较,模型组、低剂量大黄素组、中剂量大黄素组和高剂量大黄素组高糖处理H9C2细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,低剂量大黄素组、中剂量大黄素组和高剂量大黄素组高糖处理H9C2细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均逐渐降低,且低剂量大黄素组与模型组之间差异无统计学意义(P>0.05),中剂量大黄素组、高剂量大黄素组与模型组之间差异有统计学意义(P<0.05)。与低剂量大黄素组相比,中剂量大黄素组、高剂量大黄素组高糖处理H9C2细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与中剂量大黄素组相比,高剂量大黄素组高糖处理H9C2细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平均降低,差异有统计学意义(P<0.05,见表1)。

表1 大黄素对高糖处理H9C2细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的影响Table 1 Effect of emodin on IL-6, IL-1β and TNF-α in H9C2 cells treated with high

2.3 大黄素对高糖处理H9C2细胞中miR-1224的影响

与对照组比较,模型组、低剂量大黄素组、中剂量大黄素组和高剂量大黄素组H9C2细胞中miR-1224的表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05)。与模型组比较,低剂量大黄素组、中剂量大黄素组、高剂量大黄素组H9C2细胞中miR-1224的表达水平逐渐降低,且低剂量大黄素组与模型组之间差异无统计学意义(P>0.05),中剂量大黄素组、高剂量大黄素组与模型组之间差异有统计学意义(P<0.05)。与低剂量大黄素组相比,中剂量大黄素组、高剂量大黄素组H9C2细胞中miR-1224的表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05)。与中剂量大黄素组相比,高剂量大黄素组H9C2细胞中miR-1224的表达水平降低,差异有统计学意义(P<0.05,见图3)。

与对照组相比,*P<0.05;与模型组相比,#P<0.05;与低剂量大黄素组相比,&P<0.05;与中剂量大黄素组相比,△P<0.05图3 大黄素对高糖处理H9C2细胞中miR-1224的影响Figure 3 Effect of emodin on miR-1224 in H9C2 cells treated with high glucose

2.4 上调miR-1224表达逆转了大黄素对高糖处理H9C2细胞凋亡的影响

与高剂量大黄素+miR-NC组比较,高剂量大黄素+miR-1224组H9C2细胞的miR-1224表达水平、凋亡率升高,Bcl-2蛋白表达水平降低,Bax蛋白表达水平升高,差异有统计学意义(P<0.05,见图4,5)。

与高剂量大黄素+miR-NC组比较,*P<0.05图4 上调miR-1224表达逆转了大黄素对高糖处理H9C2细胞凋亡率的影响Figure 4 Up-expression of miR-1224 reverses the effect of emodin on cell apoptosis rate of H9C2 treated with high glucose

与高剂量大黄素+miR-NC组比较,*P<0.05图5 上调miR-1224表达逆转了大黄素对高糖处理H9C2细胞中Bcl-2、Bax表达的影响Figure 5 Upregulation of miR-1224 reverses the effect of emodin on the expression of Bcl-2 and Bax in H9C2 cells treated with high glucose

2.5 上调miR-1224表达逆转了大黄素对高糖处理H9C2细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的影响

与高剂量大黄素+miR-NC组比较,高剂量大黄素+miR-1224组H9C2细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的水平升高,差异有统计学意义(P<0.05,见表2)。

表2 上调miR-1224表达逆转了大黄素对高糖处理H9C2细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α的影响Table 2 Up-expression of miR-1224 reverses the effect of modin on IL-6, IL-1β and TNF-α in H9C2 cells treated with high

3 讨论

糖尿病性心肌病中心肌细胞凋亡在心室重塑和心功能衰竭中起重要作用。高血糖是导致糖尿病性心肌病的最初因素,因此,高血糖诱导的心肌细胞凋亡是糖尿病性心肌病发生中必不可少的事件[11]。研究报道,30 mmol/L葡萄糖培养72 h,心肌细胞凋亡率显著增加,而24 h和48 h心肌细胞凋亡率没有显著变化[10]。本研究以高葡萄糖培养H9C2细胞72 h,发现心肌细胞的凋亡率明显高于正常葡萄糖培养的细胞凋亡,与前人研究吻合[10]。与细胞凋亡密切相关的Bcl-2家族成员可以分为两类:一类抑制细胞凋亡,例如Bcl-2,Bcl-xl;另一类促进凋亡的细胞,包括Bax,Bak和Bid[12]。在本研究中,我们发现当H9C2细胞在高葡萄糖中培养时,心肌细胞的Bax表达增加,Bcl-2表达减少,这与流式细胞仪检测细胞凋亡的结果相符。众所周知,高血糖症是糖尿病的主要临床表现,它与慢性炎症相关,高血糖症可增加促炎细胞因子(如IL-6、IL-1β和TNF-α)的表达和释放[13]。抑制炎症已成为对抗糖尿病性心肌病的有吸引力的策略[14]。本研究同样检测到高糖使H9C2细胞中IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高,与以前的报告一致。

大黄素具有多种生物学活性,例如抗肿瘤[15]、抗细菌、抗病毒[16]、抗炎和抗氧化[17]。最近的研究表明,大黄素可以通过上调miR-9来保护PC-12细胞中高血糖诱导的损伤。同时,这些观察结果与p21,p16,Bax等的下调以及cyclin D1和Bcl-2的上调相符[18],本研究与此结果一致,即10,15 μmol/L大黄素提高高糖处理H9C2细胞的凋亡率、Bax水平,降低Bcl-2水平。此外,大黄素通过上调miR-21防止HaCaT细胞中脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)诱导的炎症损伤[19]。本研究中,10,15 μmol/L大黄素显著减少IL-6、IL-1β和TNF-α水平,大黄素显示出减轻炎症作用,这与以前的研究一致,此前Yang等[20]报告大黄素能够拮抗LPS刺激的H9C2细胞活力降低,以及凋亡、IL-1β、IL-6和TNF-α释放增加,减轻LPS引起的心肌细胞炎症损伤。值得注意的是,本研究观察到,5 μmol/L大黄素对高糖处理H9C2细胞损伤无明显影响。这些结果说明,大黄素可以保护心肌细胞免受高糖损伤,其功效与大黄素的浓度密切相关。

miRNA在药物功效和毒性中起着关键作用,并且通过调节相关基因的表达对药物产生潜在的临床意义[21]。据报道,大黄素可通过调节miRNA的表达来保护细胞,包括miR-21[19]、miR-223[20]和miR-25[22]。同时,糖尿病性心肌病也被证明与miRNA密切相关[23,24]。根据报道,miR-1224在H2O2处理的肝细胞中表达增强,其敲除减轻了H2O2诱导的肝细胞活力抑制和细胞凋亡[9]。体内和体外缺血再灌注后,肝细胞中的miR-1224被上调,miR-1224通过靶向抗凋亡基因Nfib抑制急性肝衰竭细胞增殖[25]。注射LPS 6 h的小鼠脾脏中,miR-1224表达增加了5.7倍,miR-1224转染到RAW264.7细胞中会导致LPS诱导的TNF,IL-1β和IL-6表达降低[26]。这些研究显示miR-1224通过调节凋亡和炎症而对细胞损伤产生保护作用。在我们的研究中,H9C2细胞中miR-1224的表达被高糖处理显著上调,而被10,15 μmol/L大黄素所下调。此外,miR-1224过表达逆转了大黄素对高糖所致H9C2细胞损伤的保护作用,表现为15 μmol/L大黄素和miR-1224的过表达使高糖处理H9C2细胞的凋亡率、Bax蛋白表达、IL-6、IL-1β和TNF-α水平升高,而Bcl-2水平降低。这说明大黄素通过下调miR-1224发挥了对高糖处理心肌细胞的保护效果。

总之,本研究的结果表明,大黄素在高糖处理H9C2细胞损伤中具有保护功能。大黄素可能通过下调miR-1224来减轻高糖诱导的心肌细胞凋亡和炎症。因此,大黄素和miR-1224干预可能潜在地帮助治疗糖尿病性心肌病。