十溴联苯醚染毒对大鼠学习记忆及海马NMDA受体的影响

2022-05-24吴思谋汪春梅

西南医科大学学报 2022年3期

杨清，吴思谋，汪春梅，汤艳

西南医科大学公共卫生学院：1.公共卫生；2.预防医学（泸州 646000）

十溴联苯醚（decabromodiphenyl ether，BDE-209）是一种高产量溴化阻燃剂，是多溴联苯醚类（PBDEs）阻燃剂中使用最广泛的一种，适用于橡胶及塑料制品、纺纱、电子等行业[1-2]。十溴联苯醚因为化学性质稳定、在生物体中的蓄积能力强等特点，在生产生活中可经多种途径进入机体并蓄积。国内外动物实验和人群流行病学研究结果显示，十溴联苯醚具有致癌、生殖毒性、神经毒性作用等[3-6]。中国的阻燃剂需求量被认为是亚洲最高的国家，国内研究发现，与国外相同行业的职业人群相比，中国电子废弃物处理厂的设备拆卸工人暴露于十溴联苯醚的含量高50倍～200倍[7-8]，提示中国橡胶、电子产品等行业工人的职业暴露相比国外更多，其对神经系统的损害可能更加严重。NMDA受体是一种谷氨酸门控离子通道，广泛分布于人和哺乳动物大脑海马回中的各个区域，在调节神经元突触交流以及传递神经递质过程中起着至关重要的作用，因此被认为在动物的学习以及维持记忆方面有着重要的作用[9-11]。有研究发现，NMDA 受体的激活与记忆的形成有关[12]，其在大脑海马组织表达的相对数量变化以及功能异常可能是导致大脑记忆力下降的原因之一[13]。本研究针对BDE-209 的职业暴露在前期研究的基础上探讨了BDE-209染毒对成年大鼠学习记忆和NMDA受体的影响，以探究BDE-209损害学习记忆的可能机制，为预防BDE-209的职业神经毒性提供科学参考依据。

1 对象与方法

1.1 实验对象、分组及染毒方法

选用符合标准的健康雄性SPF级SD大鼠32只（由西南医科大学动物实验中心提供，经动物伦理学委员会批准，编号：2015002），体重250～300 g。动物房需要自然采光。温度和相对湿度分别控制在（25±1）℃和（50±10）%。饲喂大鼠的垫层每天更换，每周清洗。在实验中，用自来水及完全营养的饲料喂养。

在饲养性喂养1 周后，将32 只大鼠按数字随机法分至4个不同处理组，包括对照组（花生油），低，中，高剂量（250，500，1 000 mg/kg）BDE-209 染毒组。将染毒溶剂BDE-209 按照不同浓度溶解于花生油中，于每天9：00～11：00 进行管饲染毒，容量为5 mL/kg。对照组以相同的方式接受5 mL/kg 花生油处理，每天一次，持续30 d。

1.2 仪器和试剂

Morris 水迷宫实验系统（北京硕林苑科技有限公司）；超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司）；超低温冰箱（美国Forma 公司）；凝胶成像分析系统（美国BIO-RAD 公司）；高速低温离心机（德国Eppendorf 公司）；制冰机（日本三洋公司）；RT-PCR 仪（美国ABI 公司）；核酸蛋白质检测仪（美国Nanodrop 公司）。

BDE-209（美国AccuStandard 公司）；Rever Tra Ace联合RT-PCR 试剂盒（成都博瑞克生物技术有限公司）；Trizol试剂和二亚丙二酯（Invitrogen 公司）；溴化乙锭（上海生物工程有限公司）；所用其他试剂均为国产或进口分析纯。

1.3 大鼠学习和记忆能力的测定

染毒结束后，用Morris 水迷宫检测BDE-209 暴露对成年大鼠学习记忆能力的影响。

1.3.1 定位航行实验连续进行4 d 的定航实验，将大鼠面朝池壁依次按照东、西、南、北四个起始位置放入已经浑浊处理的水中，让它们在水池中自由游动寻找平台。在120 s内，如果大鼠找到平台，信息收集系统将自动停止计时；如果大鼠未找到平台，它将被引导至该位置并停留10 s，记录120 s的逃生潜伏期。

1.3.2 空间搜索实验第5 d，将大鼠以同样的方式（面朝池壁）从原始平台的另一侧放入水中，并记录120 s内穿过原有平台相应位置的次数，即垮台次数。

1.4 大鼠海马组织内NMDA受体亚单位相对含量的测定

1.4.1 取材在水迷宫实验结束后的第2 d，用2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，断颈处死，在冰台上对海马组织进行剥离，洗净用冰NS 水（生理盐水），将海马组织快速冰冻固定，－80℃冰箱保存。

1.4.2 海马组织总RNA 的提取将放置于－80°C 冰箱中的海马组织样本取80 mg，剪切成小块并全部转移到组织均浆器中，加入1 mL Trizol试剂均匀化处理，再放置于室温条件下静置5 min后，加入0.2 mL氯仿并充分摇晃震荡15 s。再次在室内环境温度下静放5 min，并离心15 min。通过加入1 mL 75 %乙醇彻底混合底部RNA沉淀，离心并弃去清液层。将离心管放在干净的吸水性纸上，于室内环境温度下干燥10 min，再用RNase-free的ddH2O溶解。核酸蛋白质检测器上检测提取的总RNA的浓度和纯度。

1.4.3 cDNA 的合成以1 μg 总RNA 为模板，配置20 μL 反应系统：总RNA 1 μg，dNTP Mixture 2 μL，5×RT buffer 4 μL，Super RI 0.5 μL，RF增强剂0.5 μL，随机引物1 μL，Rever Tra Ace反转录酶1 μL组成，补充DEPC水至最终体积20 μL。根据以下步骤进行cDNA 合成：30°C持续10 min，42°C持续20 min，99°C持续5 min。

1.4.4 PCR目的基因扩增将上述产物用于进一步的PCR扩增。反应体系包含cDNA 2 μL，2×Taq PCR Mas⁃terMix 10 μL，上游和下游引物各1 μL，并补足水至20 μL 的最终体积。基因名称，相应的引物序列和扩增条件示于表1中。

1.5 数据分析

统计分析软件选用SPSS 25.0，计量资料用平均值±标准差（±s）表示，重复测量数据用单因素重复方差分析，多样本均值的比较采用单因素方差分析（one-way ANOVA），两两比较用于LSD 法，P<0.05 为有统计学意义。PCR 分析软件Quantity One 用于检测RT-PCR 扩增产物的光密度值，目的基因与内参基因光密度比值反映目的基因相对表达水平。

2 结果

2.1 成年大鼠学习记忆情况

2.1.1 定航实验染毒剂量和实验时间有交互作用（F组别*时间=3.71，P<0.05）；不同时间段各组成年大鼠的逃生潜伏期均有差异（P <0.05），随着实验次数增加，逃生潜伏期呈下降趋势（P<0.05）；在同一时间期，对照组大鼠的逃生潜伏期较染毒组有明显的缩短（P<0.05），随着染毒剂量增加，逃生潜伏期呈上升趋势（P<0.05），见表2。

表2 BDE-209染毒对成年大鼠逃生潜伏期的影响（±s，n=8）Table 2 Effect of BDE-209 exposure on escape latency of adult rats（±s，n=8）

注：与溶剂对照组比较，aP< 0.05；与低剂量组比较，bP<0.05；与中量组比较，cP< 0.05；与第1 d比较，dP< 0.05；与第2 d比较，eP< 0.05；与第3 d比较，fP< 0.05

2.1.2 空间搜索实验与溶剂对照组和低剂量组比较，中、高剂量组成年大鼠跨台次数均减少，皆有显著性差异（P<0.05），高剂量组成年大鼠的跨台次数显著低于中剂量组（P<0.05），见表3。

表3 BDE-209染毒对成年大鼠跨台次数的影响（±s，n=8）Table 3 Effect of BDE-209 exposure on cross-platform times in adultrats（±s，n=8）

注：与溶剂对照（0 mg/kg）组和低剂量组比较，aP< 0.05；与中剂量组比较，bP< 0.05

2.2 成年大鼠海马组织NMDA 受体亚单位mRNA 相对表达情况

2.2.1 成年大鼠海马组织NR1亚单位mRNA相对表达情况由图1可见，大鼠海马体中NR1 mRNA相对含量与溶剂对照组相比，存在显著差异（F=321.01，P <0.001）。各剂量BDE-209 染毒组大鼠海马NR1 mRNA表达的相对含量显著低于溶剂对照组（P<0.05），随着BDE-209 染毒剂量的升高，NR1亚单位mRNA的相对表达呈下降趋势（P<0.05）。

图1 各组成年大鼠海马组织NR1亚单位mRNA相对表达情况Figure 1 Relative expression of NR1 subunit mRNA in hippocampus of rats in each group

2.2.2 成年大鼠海马组织NR2A亚单位mRNA相对表达情况由图2 可见，大鼠海马体中NR2A mRNA相对含量与溶剂对照组相比，存在差异显著（F=18.69，P <0.001）。低、中、高剂量BDE-209 染毒组成年大鼠海马NR2A mRNA表达的相对含量显著低于溶剂对照组（P <0.05）；且中剂量组低于低剂量、高剂量组（P <0.05）。

图2 各组成年大鼠海马组织NR2A亚单位mRNA相对表达情况Figure 2 Relative expression of NR2A subunit mRNA in hippocampus of rats in each group

2.2.3 成年大鼠海马组织NR2B亚单位mRNA相对表达情况由图3 可见，大鼠海马体中NR2B mRNA相对含量与溶剂对照组相比，存在差异显著（F=180.87，P <0.001）。各剂量BDE-209 染毒组成年大鼠海马NR2B mRNA表达的相对含量显著低于溶剂对照组（P<0.05），随着BDE-209 染毒剂量的升高，NR2B 亚单位mRNA的相对表达呈下降趋势（P<0.05）。

图3 各组成年大鼠海马组织NR2B亚单位mRNA相对表达情况Figure 3 Relative expression of NR2B subunit mRNA in hippocampus of rats in each group

2.2.4 成年大鼠海马组织NR2C亚单位mRNA相对表达情况由图4 可见，大鼠海马体中NR2C mRNA相对含量与溶剂对照组相比，存在显著差异（F=12.17，P<0.001）。与溶剂对照组比较，各剂量BDE-209染毒组大鼠海马NMDA受体NR2C 亚单位mRNA 表达的相对含量均降低（P<0.05）；低、中、高染毒组之间NR2C亚单位mRNA的相对表达含量没有明显变化（P>0.05）。

图4 各组成年大鼠海马组织NR2C亚单位mRNA相对表达情况Figure 4 Relative expression of NR2C subunit mRNA in hippocampus of rats in each group

2.2.5 成年大鼠海马组织NR2D亚单位mRNA相对表达情况由图5 可见，大鼠海马体中NR2D mRNA相对含量与溶剂对照组相比，总体存在显著差异（F=22.14，P<0.001）。高剂量BDE-209染毒组成年大鼠海马NR2D mRNA表达的相对含量明显低于溶剂对照组、低、中剂量染毒组（P<0.05）；溶剂对照组、低、中剂量染毒组之间NR2D mRNA的相对表达含量差异无统计学意义（P>0.05）。

图5 各组成年大鼠海马组织NR2D亚单位mRNA相对表达情况Figure 5 Relative expression of NR2D subunit mRNA in hippocampus of rats in each group

3 讨论

3.1 BDE-209染毒对大鼠学习记忆能力的影响

Morris 水迷宫实验内容包括定位航行实验和空间探索实验等，是一种测定实验动物对空间位置觉和空间定位学习记忆能力的经典实验[14]。逃生潜伏期是反映受试动物在定航实验中对空间信息的收集处理然后再利用，顺利找到隐藏在浑浊水中的平台，从水中逃脱的能力；垮台次数是反映受试动物找到原有平台位置的记忆能力，这两个指标综合反映了受试毒物对动物学习记忆能力的影响。本实验结果显示，在同一训练时间，与溶剂对照组比较，BDE-209染毒的各剂量组成年大鼠的逃生潜伏期延长，且随着染毒剂量的增加而增加，垮台次数减少，且随着染毒剂量的增加而降低，这与前期课题组对大鼠BDE-209 染毒的结果[15]一致，再次证实BDE-209 具有一定的神经行为毒性。BDE-209是一种常用的电子阻燃剂，在电子设备生产回收业中广泛使用，在这些行业的职业人员长期低浓度的暴露于BDE-209，其血清中的BDE-209 浓度远高于一般人群[16]，说明相对于一般人群，BDE-209对职业暴露人群的神经系统损害的程度更为严重[17-18]。

3.2 NMDA受体与学习记忆的关系

NMDA受体是兴奋性氨基酸受体（excitatory amino acids receptor，EAAR），于中枢神经系统中分布广泛，在海马及大脑皮层分布最为密集[19-20]。有研究发现，NMDA受体在大脑海马组织表达的相对数量变化以及功能异常，可能是导致大脑记忆力下降的原因之一[13]。NMDA 受体是由四个不同作用的单体组成的多聚体，目前发现组成NMDA 受体的亚单位有3 种类别：NR1、NR2（NR2A-NR2D）、NR3（NR3A、NR3B）[21-22]。NR1是NMDA 受体的基本功能单位，在人和哺乳动物的中枢系统中的分布呈现广泛性，NR1亚单位的减少将直接影响NMDA受体的数量；NR2是调节亚单位，发挥着调节离子通道开闭状态的作用，其中的NR2B亚单位被认为是“聪明基因”[23-24]，主要是由于NR2B亚单位的第589位天冬氨酸残基对Ca2+的内流起着决定性的作用[25]。GIELEN 等[26]发现，NR1与NR2亚基结合，才能形成高度活性功能的NMDA受体通道，调节Ca2+的内流。本实验结果显示，对大鼠进行BDE-209染毒后，大鼠海马体中的NR1和NR2B亚单位的数量显著减少，随着BDE-209染毒剂量的增加，观察到相对表达含量呈递减趋势，提示BDE-209可能通过破坏大鼠海马体中的NR1和NR2B亚单位的结构，导致海马组织中具有功能活性的NMDA受体的数量减少，失去对Ca2+的调控作用，从而使学习记忆能力下降。

NR2家族的其他成员也是组成NMDA受体的调节亚单位，NR2A主要分布在皮层和海马等部位，NR2C主要分布在小脑，NR2D则在皮质下区域以及脑干间脑部位存在[27]。在本实验中，BDE-209染毒会引起大鼠海马组织中NR2A和NR2C亚单位数量减少，提示BDE-209可以破坏NR2A和NR2C亚单位结构；高剂量的BDE-209 染毒会导致大鼠海马组织中NR2D亚单位的数量降低，这提示当BDE-209浓度较高时，对NR2D亚单位结构也有损害作用，导致NMDA 功能活性受体数量下降，进而导致学习能力降低。