范安妮,汪惠丽

(合肥工业大学 食品与生物工程学院,安徽 合肥 230601)

双酚A是一种内分泌干扰化学物质,主要用于聚碳酸酯树脂和环氧树脂的生产。因为其制成的合成聚合物具有良好的机械性能,所以广泛用于生产各种产品,包括食品容器、水管、眼镜、热敏纸、牙科密封、胶油漆、黏合剂等[1]。当这些日常物品在高温或酸碱性情况下发生水解反应,双酚A能够从中游离出来渗透到食物中从而被人体摄入,特别是罐头食品[2](包括罐装蔬菜水果、鱼肉类罐头、奶粉)。此外在日常生活环境(如空气、土壤、水和灰尘)中双酚A存在广泛分布[3]。有研究表明,在不同国家和地区的普通人群中,超过90%的尿液样本中检测到双酚A及其代谢物[4]。越来越多的流行病学研究表明,双酚A暴露与患某些疾病的风险有关,如生殖类疾病、免疫疾病、代谢疾病、癌症[5-6],特别是双酚A容易通过血脑屏障,对神经系统产生不利影响。

文献[7]表明双酚A能够影响包括组蛋白乙酰化在内的表观遗传机制。表观遗传是指在基因的核苷酸序列不发生改变的条件下,基因表达发生了可遗传的变化,并最终导致表型的改变。表观遗传学主要包括DNA修饰、组蛋白修饰、非编码RNA修饰等几种机制[8]。其中,组蛋白修饰是一种重要的表观遗传机制,研究比较多的组蛋白修饰主要包括甲基化、乙酰化和泛素化等。组蛋白的乙酰化由组蛋白乙酰化转移酶(HDACs)和组蛋白去乙酰化酶(HATs)来调节,两者共同作用,调节组蛋白的乙酰化程度呈现动态平衡。组蛋白乙酰化时,染色质呈疏松状态,有利于转录因子与DNA结合,促进基因的转录;组蛋白去乙酰化时,染色质呈致密状态,不利于转录因子与DNA结合,抑制基因的转录[9]。本研究选择大鼠肾上腺嗜铬瘤(PC12)细胞为实验模型,检测双酚A暴露对HDACs和HATs的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验仪器

SCO6AD二氧化碳细胞培养箱(SHELLAB),SG403A-HE-INT无菌生物安全柜(Qualer),CT14RD高速冷冻离心机(天美),Nano Drop 2000超微量分光光度计(Thermo),Veriti-DX聚合酶链式反应(polymerase chain reaction,PCR)热循环仪(ABI),LightCycler 96 实时荧光定量PCR仪(Roche)等。

1.1.2 主要试剂

双酚A(Sigma),总RNA小量制备试剂盒(Axygen);反转录试剂盒First-Stand cDNA Synthesis SuperMix、2×EasyTaq PCR SuperMix、实时荧光定量PCR试剂盒(北京全式金生物技术有限公司);DMEM细胞培养基;胎牛血清FBS(四季青)。

1.2 实验方法

1.2.1 细胞的培养

实验中所使用的PC12细胞购于中国科学院细胞生物学研究所。从液氮中迅速取出冻存的细胞,在37 ℃水浴锅轻轻晃动,融化后立刻转移到离心管中,离心机室温下3 000 r/min离心3 min后弃去培养基,然后加入新鲜的培养基(DMEM、10% FBS、1% PS)重悬细胞,使细胞均匀地铺满细胞培养皿。在细胞培养箱中培养48 h,培养条件为温度37 ℃、湿度95%、5%CO2。当细胞密度为80%～100%时,进行细胞传代培养。弃去皿内培养基,加入PBS缓冲液轻轻冲洗并弃去,加入胰蛋白酶在二氧化碳细胞培养箱中消化1 min,再加入新鲜的培养基终止消化过程。用离心机3 000 r/min离心3 min收集细胞,弃去上清液,加入新鲜培养基重悬并均匀铺满细胞培养皿。如此传代培养3次后,细胞可用于实验操作。实验过程中,细胞培养24 h后密度达到60%～80%,此时加入双酚A处理24 h后提取RNA样品。双酚A使用二甲基亚砜溶解,添加到细胞培养皿中与培养基混合均匀,使得终浓度为1 μmol/L。

1.2.2 RNA的提取

使用Axygen的总RNA小量制备试剂盒提取RNA。因为RNA易降解,所以所有操作都需在低温下进行。从培养箱中取出细胞培养皿,弃去培养基,用PBS缓冲液轻轻冲洗2次。加入R1缓冲液裂解细胞并轻柔地刮下细胞,收集到离心管中。再向每个离心管中加入R2缓冲液终止反应,漩涡震荡3次,每次震荡10 s,并用离心机在4 ℃、2 000g离心5 min。将试剂盒中提供的吸附柱放进离心管中,收集离心的上清液于吸附柱中,缓慢地加入异丙醇,轻轻颠倒混匀,然后用离心机4 ℃、6 000g离心2 min。弃去离心滤液,将吸附柱放回离心管中,向吸附柱中加入W1A缓冲液,离心机4 ℃、12 000g离心2 min。离心后弃滤液,向吸附柱中加入W2缓冲液,离心机4 ℃、12 000g离心2 min。重复此步骤2次。离心后弃滤液,离心机4 ℃、12 000g离心2 min,空转彻底除去W2缓冲液。将吸附柱放入新的离心管中,向吸附柱中滴加TE洗脱液,室温下静置2 min,离心机室温下12 000g离心2 min收集RNA。利用Nano Drop 2000超微量分光光度计检测RNA浓度和质量,提取的RNA用于反转录实验。

1.2.3 反转录

使用First-Stand cDNA Synthesis SuperMix试剂盒进行RNA反转录获得cDNA。RNA易降解,因此所有操作都需在低温下进行。具体实验反应体系和反应程序如下。

反应体(20 μL):提取的总RNA 需50 ng～5 μg,2×ES Reaction 10 μL,Anchored Oligo (dt) 1 μL,Easy Script RT/RI Enzyme MIX 1 μL,加入ddH2O 至总体积为20 μL。如上添加试剂后,轻轻吹打混匀,用微型离心机离心使反应试剂都置于EP管底,再将EP管放置于PCR仪中,设置逆转录程序。

反应程序为:42 ℃孵育15 min,85 ℃ 加热5 min变性失活。反应结束后获得cDNA直接稀释到合适浓度,进行实时荧光定量PCR。

1.2.4 实时荧光定量PCR

实验使用实时荧光定量PCR试剂盒在LightCycler 96 实时荧光定量PCR仪上进行实时荧光定量PCR。先将引物稀释成10 μmol/L,再将之前反转录所得的cDNA作为模板,加样过程在低温下进行。

反应体系(20 μL):SYBR premix dimer Eras (2×)10 μL,上游引物0.4 μL,下游引物0.4 μL,模板cDNA 2 μL,ddH2O 6.4 μL。如上添加试剂后,轻轻吹打混匀,用微型离心机离心使反应试剂都置于EP管底。实验过程中保持EP管和仪器内部的干净。

反应的程序为:先预变性(95 ℃、30 s、1 个循环),PCR反应(95 ℃、10 s; 60 ℃、30 s、40个循环),然后进行溶解曲线分析(95 ℃、10 s; 65 ℃、60 s; 97 ℃、1 s; 0.5 ℃、1 s),最后冷却(37 ℃、30 s)。实验所用引物序列见表1所列。结束后,分析实验结果。本实验主要是用于检测HDACs和HATs的基因水平。

表1 引物序列

1.3 数据分析

实验数据用GraphPad Prism 8 软件处理,实验结果表示为(平均值±标准差),组间差异显著性分析采用t检验和One-way ANOVA检验,显著性水平取P<0.05(*),显著相关;P<0.01(**),明显显著相关;P<0.001(***)，极显著相关。

2 结果与分析

2.1 双酚A暴露对HDACs的基因表达影响

HDACs广泛存在于各生物体内,目前发现共有18种,HDACs根据酵母同源性分析被分成4类。Ⅰ类HDACs常在细胞核中检测到,由HDAC1、HDAC2、HDAC3和HDAC8组成,与酵母Rpd3蛋白具有同源性;Ⅱ类HDACs和Hda1有高度同源性,细分为Ⅱa类HDACs (HDAC4、 HDAC5、HDAC7、HDAC9)和Ⅱb类HDACs (HDAC6、HDAC10),可在细胞质和细胞核之间穿梭;Ⅳ类HDAC的唯一成员是HDAC11,与Rpd3 和Hda1 都有同源性。这3类HADCs酶活性都依赖于锌离子结构域。而Ⅲ类HDACs是一类依赖于烟酰胺腺嘌呤核苷酸的去乙酰化酶,与酵母Sir2同源。实时荧光定量PCR检测PC12细胞中HDACs不同亚型的mRNA表达水平。双酚A暴露后细胞中HDACs的mRNA水平变化如图1所示。

蛋白(a) Ⅰ类HDACs

由图1可知，与对照组相比,双酚A暴露后,Ⅰ类组蛋白去乙酰化酶HDAC1和HDAC8的mRNA水平上升较明显(P<0.01),HDAC2和HDAC3 的mRNA水平显著上升(P<0.001),即双酚A暴露后,4种Ⅰ类组蛋白去乙酰化酶均明显上升；Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶HDAC4的mRNA水平没有明显的变化趋势，HDAC5 的mRNA水平上升较明显(P<0.01),HDAC9的mRNA水平也明显上升(P<0.05),即双酚A暴露后,2种Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶均明显上升；Ⅳ类组蛋白去乙酰化酶HDAC11也显著升高。

2.2 双酚A暴露对HATs的基因表达影响

基于序列和结构的相似性, HATs分为Gcn5/PCAF、MYST、P300/CBP 和Rtt109至少4个不同家族。Gcn5/PCAF 家族由Gcn5/PCAF 和相关蛋白组成;MYST家族从酵母到人类细胞中都是保守的,是HATs家族中最大的成员,调控许多生命活动过程;P300/CBP家族成员均为转录辅助因子,能乙酰化组蛋白和非组蛋白;Rtt109家族与组蛋白分子伴侣Asf1和Vps75 相关,在DNA 复制和基因组稳定性维持中起重要作用。双酚A暴露后细胞中HATs的mRNA水平变化如图2所示。

图2 HATs的相对mRNA表达水平

由图2可知,与对照组相比,双酚A暴露较对照组的组蛋白乙酰化转移酶HAT1的mRNA水平显著上升(P<0.001),组蛋白乙酰化转移酶P300的mRNA水平也明显上升(P<0.05),组蛋白乙酰化转移酶MYST的mRNA水平没有明显的变化趋势。MYST作为一个激活基因的表观遗传标志,主要负责H4K16的乙酰化,可能此处乙酰化的变化不涉及组蛋白H4赖氨酸16位点的乙酰化。

3 讨 论

组蛋白乙酰化在学习和记忆过程中、神经病理学(精神分裂症、抑郁症和药物成瘾)中、维持正常认知等方面都起着重要的作用。研究表明,进行各种学习训练后啮齿动物显示出组蛋白乙酰化的瞬时增加[10]。而用组蛋白去乙酰化酶的抑制剂治疗后,野生型小鼠和大鼠的学习能力和突触可塑性也得到了促进,这表明组蛋白乙酰化增加是记忆形成的重要机制。

HDAC1功能的丧失与神经变性有关。在CK-p25快速神经变性小鼠模型中,p25使HDAC1失活先于阿尔兹海默症,导致双链DNA断裂,细胞周期蛋白表达异常和神经元死亡。在脑卒中模型中,HDAC1的获得同样对缺血诱导的神经元死亡具有保护作用[11]。HDAC1活性在亨廷顿舞蹈病的秀丽隐杆线虫模型中被发现具有神经保护作用。HDAC2在认知功能中的作用与HDAC1形成鲜明对比。在前脑神经元中过表达HDAC1的小鼠在认知表型上无差异,而过表达HDAC2导致记忆形成和突触可塑性的显著损伤[12]。HDAC2是HDAC抑制剂增强记忆的主要(不是唯一)靶点,有数据显示HDAC2在成年海马神经元突触可塑性中起抑制作用[13]。还有一些证据表明,HDAC2依赖的机制与认知能力下降有关。因此,靶点HDAC2可能适用于与认知功能受损相关疾病的治疗。HDAC3介导了与亨廷顿病相关的神经毒性,在秀丽隐杆线虫亨廷顿病模型中,HDAC3的缺失可以消除疾病[14]。在哺乳动物中,HDAC3似乎对心脏能量代谢特别重要,但其在神经疾病中的作用尚未被探索。有关HDAC8在成人大脑中作用的研究并不多,仅文献[15]报道HDAC8的表达与神经母细胞瘤的发生显著相关，可以通过遗传和药理手段靶向HDAC8抑制神经母细胞瘤细胞的增殖,因此HDAC8被认为是神经母细胞瘤的合适药物靶点。综上所述,以Ⅰ类HDACs为靶点是治疗某些神经退行性疾病的有效途径。

然而,Ⅱ类HDACs在成人大脑中的作用尚不完全清楚。小脑颗粒神经元中HDAC4过表达可促进神经元细胞死亡,抑制HDAC4可能具有神经保护作用。HDAC4的核移位与细胞凋亡和神经元存活有关[16]。因此,HDAC4在周围和中枢神经系统中发挥重要作用,但其价值有待进一步研究。HDAC5对认知功能方面没有明显的调控作用。然而,HDAC5是慢性应激和可卡因摄入适应性反应的关键调节因子[17]，因此HDAC5在成人大脑中的作用是微妙而重要的,可能需要对基因组环境相互作用进行微调。HDAC9在心脏和肌肉骨骼功能中起着至关重要的作用,但对其在大脑中的作用知之甚少。此外,HDAC9的CNVs被发现与精神分裂症有关[18],使得对该蛋白的进一步研究变得非常重要。HDAC11在成人大脑中的作用仍有待研究。

改变HATs活性的小鼠模型显示记忆障碍,这与通过学习增加海马体中组蛋白乙酰化的发现一致。CREB结合蛋白(CBP/P300)的突变是鲁本斯坦·泰比综合征的大多数病例,这种疾病的特征是智力低下。文献[19]表明,CBP的缺失会损害海马组蛋白乙酰化,并导致各种记忆测试(如新型物体识别和空间记忆)受损。即使CBP的CREB结合位点发生突变,在转基因小鼠中也观察到严重的学习障碍和组蛋白乙酰化缺陷。

4 结 论

本文对PC12细胞进行双酚A暴露,探究双酚A暴露对HDACs和HATs的影响。实验发现,与对照组相比,双酚A暴露后4种Ⅰ类组蛋白去乙酰化酶(HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8)的基因水平均明显上升;2种 Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶(HDAC5、HDAC9)的基因水平也明显上升,1种 Ⅱ类组蛋白去乙酰化酶(HDAC4)没有明显的变化趋势;Ⅳ类组蛋白去乙酰化酶(HDAC11)的基因水平也显著升高。与对照组相比,双酚A暴露组的组蛋白乙酰化转移酶(HAT1、P300)的基因水平明显上升,但组蛋白乙酰化转移酶(MYST)的基因水平无明显变化。总体来说,HDACs的上升趋势比HATs明显,这可能导致整体的组蛋白乙酰化修饰水平偏低,例如H3K9、H3K27乙酰化的降低等。而整体的组蛋白乙酰化修饰水平偏低,使得染色质结构变得紧密,抑制了基因的转录。

综上所述,双酚A能够通过影响HDACs和HATs来影响表观基因组编程,而这种组蛋白乙酰化表观遗传机制可能与一些神经障碍相关的疾病有关。