徐斌 付玲钰 张波 吴辉 张旭乾

(南充市中心医院·川北医学院第二临床医学院 1.骨科；2.健康管理中心；3.病理科，四川 南充 637000)

骨肉瘤是儿童和青少年最常见的恶性骨肿瘤之一，每年全球新发病例约为400万[1-4]。骨肉瘤早期诊断较困难，目前新辅助化疗联合肿瘤切除术是骨肉瘤的主要治疗方法，但预后较差[5-7]。尽管骨肉瘤的治疗手段不断更新，但是转移或复发的骨肉瘤患者死亡率仍然很高，总生存率低于20%[8-10]。骨肉瘤患者预后差的原因是其发病机制尚不清楚且存在争议，因此进一步研究骨肉瘤增殖和转移的机制，寻找新的肿瘤标志物和治疗靶点就显得非常重要。BTG2是BTG/TOB家族中的关键基因，与包括肿瘤在内的多种生物学现象有关[11]。既往研究发现BTG2在多种肿瘤组织中低表达[12-14]，也有研究证实BTG2在骨肉瘤组织中的表达水平明显降低[15]，提示BTG2可能作为抑癌基因发挥作用，然而BTG2对骨肉瘤细胞增殖的影响及其上游调控机制尚不明确。本研究深入探讨了BTG2在骨肉瘤发病中的作用及其上游调控机制，以期为骨肉瘤的早期诊断和治疗提供新的生物标志物和作用靶点。

1 材料与方法

1.1 材料 人骨肉瘤细胞株，正常人成骨细胞hFOB1.19细胞株和3种人骨肉瘤细胞株(HOS、MG63和Saos-2)购自美国种质保藏中心。用含有10%胎牛血清的DMEM-F12(Gibco，Carlsbad，USA)培养hFOB1.19细胞。三种骨肉瘤细胞在含有100 U/mL青霉素，100 mg/mL链霉素和10%胎牛血清的DMEM(Gibco)中培养，培养箱内温度为37℃，并含有5% CO2。

1.2 细胞转染 miR-21-5p mimic、miR-21-5p inhibitor及BTG2 siRNA(5′-GCUCCAUCUGCGUCUUGUA-3′)购自RiboBio公司 (Guangzhou，China)，circ0000781过表达载体PcDNA3.1- circ0000781质粒和BTG2过表达载体PcDNA3.1- BTG2质粒购自GeneChem公司 (Shanghai，China)。根据制造商的说明，使用Lipofectamine 2000试剂(Life Technologies，Carlsbad，USA)进行转染，转染后48 h收集细胞进行后续实验。

1.3 qRT-PCR 根据制造商说明书使用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)从细胞中提取总RNA，再应用Primescript逆转录试剂盒(Takara，Otsu，Shiga，Japan)逆转录成cDNA。然后用PowerUpTM SYBRTM Green Master Mix(Applied Biosystems，美国)对cDNA进行PCR扩增。BTG2引物序列如下:5′-GCGTGAGCGAGCAGAGGCTT-3′(forward)，5′-GGCTGGCCACCCTGCTGATG-3′(reverse)。miR-21-5p引物序列如下:5′-CTTACTTCTCTGTGTGATTTCTGTG-3′(forward)，5′-ACAACCTTTCCAAAATCCATGAGGC-3′(reverse)。采用2-△△Ct法记录mRNA相对表达水平。

1.4 CCK-8 CCK-8用于检测细胞增殖能力。将处理过的细胞用胰蛋白酶消化后接种到96孔板(每孔约2000个细胞)，每组5个重复。用CCK8分析不同时间点(接种后24、48和72 h)的细胞增殖活性。

1.5 Transwell 按照制造商的说明(BD Biosciences，Bedford，MA，USA)，将预涂有Matrigel的Transwell小室用于细胞侵袭分析。1×105处理过的OS细胞添加到上室，600 ul培养基添加到下室，细胞培养24 h。在倒置光学显微镜下(Zeiss，Primovert)随机取三个视野计算侵袭细胞数。

1.6 生物信息学数据库使用 通过生物信息学数据库Targetscan(http://www. targetscan. org/vert_71/)筛选可与BTG2靶向结合的miRNA，再通过Circular RNA Interactome(https://circinteractome. nia. nih. gov/)数据库预测可与miR-21-5p靶向结合的circRNA。

1.7 荧光素酶报告实验 设计含有circ0000781野生型序列和突变型序列及BTG2野生型序列和突变型序列的荧光素酶报告质粒(Shanghai GeneChem Co)。将骨肉瘤细胞与报告质粒和miR-21-5p mimic或阴性对照模拟物(NC)共转染并培养24 h，然后用双荧光素酶报告系统(Promega)测定荧光素酶活性。

2 结果

2.1 BTG2在骨肉瘤细胞中的表达 PCR结果显示，与正常人成骨细胞hFOB1.19细胞株(0.99±0.07)相比，骨肉瘤HOS(0.65±0.05)、MG63(0.42±0.04)和Saos-2(0.71±0.06)细胞中BTG2表达水平明显降低，在MG63细胞中的表达水平最低，故选择MG63细胞进行后续实验，见图1。

图1 BTG2在细胞株中表达水平Figure 1 BTG2 expression level in cell lines

2.2 BTG2对细胞增殖的影响 通过PcDNA3.1- BTG2质粒在MG63细胞中过表达BTG2，与空载组和空白对照组相比，BTG2过表达组细胞增殖能力明显降低，差异具有统计学意义(P<0.05)，见表1。

表1 过表达BTG2对细胞增殖的影响Table 1 Effects of overexpression of BTG2 on cell proliferation

2.3 BTG2对细胞侵袭的影响 通过Transwell法发现，与空载组(92.67±5.15)和空白对照组(94.33±4.04)相比，BTG2过表达组细胞侵袭能力明显降低(36.33±2.52)，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2。

图2 BTG2对细胞侵袭的影响Figure 2 Effect of BTG2 on invasion

2.4 BTG2可与miR-21-5p靶向结合 通过Targetscan发现miR-21-5p含有BTG2的结合位点，进一步通过荧光素酶报告实验证实BTG2可与miR-21-5p靶向结合，见图3、图4。

图3 miR-21-5p与BTG2结合位点Figure 3 Binding site of miR-21-5p and BTG2

图4 双荧光素酶报告实验结果Figure 4 Luciferase reporter gene assay

2.5 miR-21-5p负调控BTG2 在MG63细胞中转染miR-21-5p mimic过表达miR-21-5p，发现与阴性对照组(miR-21-5p mimic NC)和空白对照组(Blank)相比(分别为1.00±0.08，0.97±0.06)相比，miR-21-5p过表达组中BTG2表达水平明显降低(0.59±0.04)，说明miR-21-5p负调控BTG2的表达，见图5。

图5 miR-21-5p负调控BTG2表达Figure 5 miR-21-5p negatively regulates BTG2 expression

2.6 miR-21-5p通过负调控BTG2促进细胞增殖 为证实miR-21-5p通过负调控BTG2促进细胞增殖，本研究设立对照组，miR-21-5p mimic，miR-21-5p mimic NC及miR-21-5p mimic+ BTG2过表达组，检测细胞增殖能力，结果显示与对照组和miR-21-5p mimic NC组相比，miR-21-5p mimic组细胞增殖能力明显增强，但是与miR-21-5p mimic组相比，miR-21-5p mimic+BTG2过表达组细胞增殖能力则有所降低，说明BTG2可逆转miR-21-5p对细胞增殖的促进作用，见表2。

表2 miR-21-5p通过负调控BTG2促进细胞增殖Table 2 miR-21-5p promoted cell proliferation by negatively regulate BTG2

2.7 miR-21-5p通过负调控BTG2促进细胞侵袭 为证实miR-21-5p通过负调控BTG2促进细胞侵袭，本研究设立对照组，miR-21-5p mimic，miR-21-5p mimic NC及miR-21-5p mimic+ BTG2过表达组，检测细胞侵袭能力，结果显示与对照组(39.00±2.00)和miR-21-5p mimic NC组(37.67±4.51)相比，miR-21-5p mimic组(84.00±3.00)细胞侵袭能力明显增强，但是与miR-21-5p mimic组相比，miR-21-5pmimic+ BTG2过表达组(64.67±4.04)细胞侵袭能力则有所降低，说明miR-21-5p对细胞侵袭的促进作用可被BTG2逆转，见图6。

图6 miR-21-5p通过负调控BTG2促进细胞侵袭Figure 6 miR-21-5p promoted cell invasion by negatively regulate BTG2

2.8 circ0000781可与miR-21-5p靶向结合 通过Circular RNA Interactome发现，circ0000781含有miR-21-5p结合位点，进一步通过通过荧光素酶报告实验证实circ0000781可与miR-21-5p靶向结合，见图7、图8。

图7 circ0000781与miR-21-5p可能结合位点Figure 7 Binding site of circ0000781 and miR-21-5p

图8 双荧光素酶报告实验结果Figure 8 Luciferase reporter gene assay

2.9 circ0000781负调控miR-21-5p表达 通过PcDNA3.1-circ0000781质粒在MG63细胞中过表达circ0000781，发现与空载组(Vector)和空白对照组(Blank)相比(分别为1.03±0.04，0.97±0.06)，circ0000781过表达组miR-21-5p表达水平明显降低(0.60±0.07)，证实circ0000781可下调miR-21-5p表达，见图9。

图9 circ0000781负调控miR-21-5p表达Figure 9 circ0000781 negatively regulates miR-21-5p expression

2.10 circ0000781通过负调控miR-21-5p上调BTG2表达 本研究设立对照组，circ0000781过表达组，PcDNA3.1-circ0000781 NC(空载组)组及circ0000781过表达+miR-21-5p mimic组，结果发现与对照组(0.70±0.07)和空载组(0.72±0.06)相比，circ0000781过表达组中BTG2表达水平明显增高(0.90±0.06)，但是与circ0000781过表达组相比，circ0000781过表达+miR-21-5p mimic组中BTG2表达水平则有所降低(0.79±0.04)，说明miR-21-5p可逆转circ0000781对BTG2表达的促进作用，见图10。

图10 circ0000781通过负调控miR-21-5p上调BTG2表达Figure10 circ0000781 upregulated BTG2 expression by negatively regulate miR-21-5p

3 讨论

BTO/TOB家族是20世纪90年代发现的一个抗增殖蛋白家族。既往研究发现BTG2在多种组织中均有表达，参与细胞分化、增殖、DNA损伤修复及细胞凋亡等多种生物活性。研究表明BTG2可使细胞周期阻滞在G0和G1期从而抑制细胞增殖，也有研究发现BTG2可通过调控p38和MAPK信号通路下调口腔鳞癌细胞增殖活性[16-17]。Gu等[15，18]的研究证实BTG2在骨肉瘤组织中低表达，并且BTG2可通过PI3K-AKT信号通路抑制骨肉瘤细胞增殖和转移。本研究也发现BTG2在骨肉瘤细胞中的表达水平相比于正常人成骨细胞明显降低，并且过表达BTG2可明显抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭能力，证实BTG2在骨肉瘤中扮演着抑癌基因的角色，与既往结果相符，表明BTG2是一个极具前景的骨肉瘤治疗新靶点。

虽然本研究表明BTG2在骨肉瘤中作为抑癌基因发挥作用，然而调控其表达的上游机制尚不明确。miRNA是一类单链非编码小RNA(18-25nt)，它们广泛存在于真核生物中并可与靶基因的3-UTR结合，通过mRNA降解或翻译抑制负调控基因表达[19]。通过生物信息学数据库Targetscan我们发现BTG2 mRNA的3-UTR中含有miR-21-5p的结合位点，进一步双荧光素酶报告基因法证实BTG2可与miR-21-5p靶向结合。miR-21-5p对肿瘤发生发展的调控作用已得到广泛的证实。如miR-21-5p通过靶向SMAD7促进非小细胞肺癌增殖、迁移和侵袭，并且miR-21-5p在复发性胃癌中高表达，可作为胃癌的潜在预后因子[20-21]。除此之外Zhang等[22]的研究发现miR-21-5p在骨肉瘤组织中高表达，然而miR-21-5p在骨肉瘤中的调控网络尚不清楚。本研究发现miR-21-5p可负调控BTG2的表达，miR-21-5p还可促进骨肉瘤细胞增殖和侵袭，然而miR-21-5p对骨肉瘤细胞增殖和侵袭的促进作用可被BTG2逆转，证实miR-21-5p作为癌基因通过抑制抑癌基因BTG2的表达促进骨肉瘤细胞增殖和侵袭。

进一步我们探讨了miR-21-5p的上游调控基因。基于环状 RNA(circularRNAs，circRNAs)在肿瘤中的重要作用及其与microRNA的密切关系，我们将目光转向circRNAs。circRNA是一类双链闭合 RNA，其 3′和 5′末端连接形成共价闭合的环状结构，大部分属于非编码RNA[23]。研究表明，circRNA 在肿瘤中可以作为“海绵”来阻断及竞争性抑制 miRNA 来发挥作用，因此circRNA可以作为内源性竞争 RNA 参与肿瘤的发病[24]。鉴于circRNA 在肿瘤发生中的重要作用，我们通过生物信息学数据库Circular RNA Interactome筛选可与miR-21-5p靶向结合的circRNA，发现circ0000781含有miR-21-5p结合位点，接下来的荧光素酶报告实验证实circ0000781可与miR-21-5p靶向结合，并且circ0000781可负调控miR-21-5p表达。本研究还发现circ0000781可上调BTG2的表达，但是过表达miR-21-5p后BTG2的表达水平则明显降低，说明miR-21-5p可逆转circ0000781对BTG2表达的促进作用。

4 结论

本研究结果显示，BTG2在骨肉瘤细胞中低表达并可抑制骨肉瘤细胞增殖和侵袭。进一步在探寻BTG2上游调控机制的过程中发现circ0000781可作为海绵竞争性抑制miR-21-5p的表达，最终通过上调BTG2的表达降低骨肉瘤细胞的增殖活性和侵袭能力。这表明circ0000781/miR-21-5p/BTG2信号轴可作为骨肉瘤治疗的潜在作用靶点。