陈恳，冯海娟，王海云，许伟

结直肠癌是我国乃至全世界范围内最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率位列所有肿瘤的第四位，而死亡率却高居所有恶性肿瘤的第二位，严重威胁着人类的生命健康［1-3］。手术切除是目前结直肠癌的主要治疗方式，然而术后高复发与转移使结直肠癌患者的总体预后仍然无法令人满意［4-5］。深入了解结直肠癌发生发展的分子机制，寻找预后分子标志对于肿瘤复发转移的早期预测与个体化治疗策略的制定具有极为重要的临床意义。

目前，肿瘤干细胞被认为是导致肿瘤复发转移，并对化疗药物产生抗药性的重要原因之一［6］。作为一种肠道成体干细胞的标记物之一，富含亮氨酸重复单位的G蛋白耦联受体5（Leucine-rich，repeat-containing，G-proteinecoupled receptor 5，LGR5）具有特异性的干细胞活性［7-8］。研究发现LGR5是Wnt信号通路的靶基因之一，而LGR5+结肠干细胞可在Wnt通路异常激活的情况下逐渐形成增殖的腺瘤，提示LGR5可能在结直肠癌的发生扮演着至关重要的角色［9］。另一方面，近年来越来越多的证据表明肿瘤免疫微环境改变直接参与了肿瘤细胞生长与转移的调控［10］。集落刺激因子1受体（colony-stimulating factor 1 receptor，CSF1R）是蛋白酪氨酸激酶受体家族的一员，作为免疫系统中的重要调节因子，CSF1R可以通过旁分泌或自分泌方式激活单核-巨噬细胞系统，促进肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移［11-12］。近年来，有研究报道CSF1R在胶质瘤、肾透明细胞癌、胃癌等肿瘤组织中存在明显异常表达，其可能是这些恶性肿瘤患者的一个潜在预后因素［13-16］。然而，尚不清楚CSF1R在结直肠癌患者中的表达水平及其预后意义。在本研究中，我们通过免疫组化染色检测了LGR5与CSF1R在结直肠癌组织中的表达水平，通过结合患者临床病理学特征与生存数据进行相关分析，旨在探索二者的临床意义与预后价值，力求为结直肠癌患者的预后评估及分子靶向治疗提供实验基础。

1 资料与方法

1.1 样本收集与病人的临床资料

回顾性选取2016年2月至2019年1月南通大学附属如皋医院初诊并行手术治疗的114例结直肠癌患者为研究对象，收集肿瘤组织及癌旁组织标本。纳入标准：①患者经术后组织病理学证实为原发性结肠或直肠腺癌；②术前未行新辅助放、化疗。排除标准：①临床病理资料或随访数据不完整者；②随访时间不足1个月者。

本研究共纳入结直肠癌患者114例，其中男65例，女49例；年龄37～88岁，平均年龄（64.6±12.3）岁；结肠癌76例（66.7%），直肠癌38例（33.3%）；中位肿瘤直径为5 cm（四分位距：3.5～5.5 cm）；根据组织学类型，高、中分化腺癌69例（60.5%），低分化腺癌45例（39.5%）；根据美国癌症联合会TNM 分期（第7版），Ⅰ期17例（14.9%），Ⅱ期30例（26.3%），Ⅲ期34例（29.8%），Ⅳ期33例（28.9%）。

同时收集患者的一般资料及临床病理特征，具体包括：年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤直径、组织学类型、肿瘤浸润深度（T分期）、淋巴结转移（N分期）、远处转移（M分期）、淋巴血管侵犯等。结直肠癌TNM分期参照美国癌症联合会第7版。本研究已通过南通大学附属如皋医院伦理审查委员会的审核，所有参与者已签署知情同意书，告知手术标本的使用目的。

1.2 免疫组化

将收集的结直肠癌组织样本通过石蜡包埋、固定并连续切片后，置于二甲苯和梯度酒精中分别进行脱蜡与水化处理。接下来，将组织切片置于柠檬酸盐缓冲液（pH值7.4）中进行抗原修复，冷却至室温，使用3% H2O2浸泡15 min，以去除内源性过氧化物酶活性。使用1%胎牛血清封闭组织切片后，分别加入LGR5抗体（Abcam公司）与CSF1R抗体（Abcam公司）于4℃下孵育过夜。次日，使用PBS缓冲液将组织切片清洗干净，分别加入生物素标记的二抗，于室温下继续孵育30 min，加入适量DAB显色，苏木素复染。免疫组化染色阳性的判定方法如下：根据染色强度，无染色为0分，浅黄色为1分，棕黄色为2分，棕褐色为3分；染色阳性细胞的比例小于5%（每高倍视野下计数200个细胞）计0分，5%～25%计1分，26%～50%计2分，51%～75%计为3分，大于75%计4分。基于染色强度与染色阳性细胞比例积分的乘积，计算免疫组化总评分，将0～4分定义为阴性表达，大于4分定义为阳性表达。

1.3 随访

所有接受手术治疗的结直肠癌患者均在术后接受常规随访，总生存期（overall survival，OS）从患者手术之日起计算至因任何原因死亡。全组病人的随访资料完整，中位随访时间为39.0个月（范围：1～61个月）。

1.4 统计方法

数据处理与采用SPSS 24.0统计软件完成。计数资料以频数或%形式表示，独立样本采用卡方χ2检验或Fisher′s精确检验；配对样本采用McNemar检验；通过Kaplan-Meier法分别绘制患者的生存曲线，生存率的比较采用Log-rank检验。采用多因素Cox比例风险回归模型分析影响结直肠癌患者预后的独立风险因素。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LGR5、CSF1R在结直肠癌样本中的表达

免疫组化染色结果展示，LGR5与CSF1R蛋白在结直肠癌组织中呈明显阳性表达，以胞浆表达为主，呈弥漫性分布；LGR5、CSF1R在结直肠癌组织中的阳性表达率分别为61.4%（n=70）和63.2%（n=72），显著高于其在癌旁组织中的表达，见图1。

图1 LGR5与CSF1R在结肠癌组织中的表达（HE，×400）A：LGR5在癌旁表达中的表达呈阴性（-）；B：LGR5在结肠癌组织中表达呈阳性（+）；C：CSF1R在癌旁表达中的表达呈阴性（-）；D：CSF1R在结肠癌组织中表达呈阳性（+）

2.2 LGR5、CSF1R表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系

LGR5阳性表达与肿瘤直径（χ2=4.938，P=0.026）、淋巴血管浸润（χ2=5.279，P=0.022）、浆膜侵犯（χ2=7.216，P=0.007）及远处转移（χ2=5.923，P=0.015）显著相关，见表1。CSF1R蛋白阳性表达者在浆膜侵犯（χ2=9.975，P=0.002）、淋巴结转移（χ2=3.797，P=0.048）及淋巴血管浸润（χ2=4.245，P=0.039）方面显著高于阴性表达者，而在年龄、性别、肿瘤位置、肿瘤直径、组织学类型等因素的比较上，无显著统计学差异（P＞0.05），见表2。

表1 LGR5表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系

表2 CSF1R表达与结直肠癌患者临床病理特征的关系

2.3 LGR5、CSF1R表达与结直肠癌患者预后的关系

LGR5阳性表达者的总生存期明显短于LGR5阴性表达者，两组患者中位OS分别为45.1个月（95%CI：35.1～55.2个月）和56.1个月（95%CI：52.4～59.8个月），差异有统计学意义（χ2=4.302，P=0.038），见图2A。CSF1R阳性表达者的中位OS为42.3个月（95%CI：24.6～60.0个月），显著低于CSF1R阴性表达者中位OS为59.2个月（95%CI：51.2～61.2个月），差异有统计学意义（χ2=5.610，P=0.018），CSF1R阳性表达提示结直肠患者预后不佳，见图2B。

图2 Kaplan-Meier曲线展示LGR5（A）、CSF1R表达（B）与结直肠癌患者预后的关系

单、多变量Cox回归分析揭示LGR5阳性表达（HR=2.385，95% CI：1.254～4.534，P=0.008）、CSF1R阳性表达（HR=3.652，95% CI：1.986～6.713，P=0.001）、TNM分期（HR=2.711，95%CI：1.366～5.380，P=0.004）及淋巴血管浸润（HR=1.940，95% CI：1.035～3.636，P=0.039）是结直肠患者预后不良的独立预测因素，见表3、表4。

表3 影响结直肠患者预后的单因素Cox回归分析

表4 影响结直肠患者预后的多因素Cox回归分析

3 讨论

结直肠癌是一种具有高度生物学异质性的恶性肿瘤，术后肿瘤复发转移是结直肠癌患者死亡的主要原因。尽管血清癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）是目前监测结直肠癌术后复发转移的常用肿瘤标志物，但其预后价值依然有限。寻找、发现新型分子标志物对结直肠癌患者的早期诊断、预后评估及个体化治疗方案的制定具有重要的临床意义。在本研究中，我们通过免疫组化染色检测了LGR5与CSF1R蛋白在结直肠癌患者中的表达水平及其预后意义。值得注意的是，我们的研究结果表明LGR5与CSF1R的表达可以作为结直肠癌患者预后不佳的独立预测因子。

LGR5一直被认为是胃肠道干细胞的重要标志之一，既往研究表明LGR5+细胞具有很强的自我更新、自我分化及增殖能力，在结直肠癌的发生发展中扮演着肿瘤干细胞的角色［17-18］。Jang等［19］研究展示LGR5在人结直肠癌前病变，特别是绒毛管状腺瘤中明显高表达，推测人类绝大多数结直肠癌可能是从LGR5+细胞发展而来。我们的结果进一步表明，LGR5在结直肠癌样本中呈明显阳性表达，分析其与临床病理参数及患者预后的关系后，发现LGR5阳性表达与肿瘤直径、淋巴血管浸润、肿瘤浆膜侵犯及远处脏器转移显著相关，是结直肠癌患者的独立预后变量。这些发现提示LGR5是肿瘤恶性表型的潜在标志，其可能作为一个癌基因促进结直肠癌的发生及转移。既往研究的结果亦支持了我们的发现，证实了LGR5表达与肿瘤浸润深度、肿瘤大小、远处转移及TNM分期等因素的相关性及其预后价值［20-24］。Gzil等［24］报道LGR5在结直肠癌组织中的阳性表达率高达92.0%，且与血管侵犯、淋巴结转移及不良预后密切相关。另一方面，分子生物学的证据表明，LGR5表达上调抑制了N-cadherin、Snail、Slug等细胞粘附分子的表达，促进上皮间质转化，进一步增加了肿瘤细胞侵袭、转移的潜能［22，25］。此外，LGR5还可能通过激活其下游的Wnt/β-catenin信号通路参与了结直肠癌的发生发展［26-27］。这些发现说明LGR5或许是结直肠癌治疗的一个有价值的靶点。

CSF1R主要与集落刺激因子1（Colony-stimulating factor 1，CSF1）形成信号轴调控单核-巨噬细胞的生长与活性，通过形成特定肿瘤微环境，介导免疫抑制，进而促进肿瘤细胞的增殖、侵袭与转移［28］。作为一种跨膜受体，CSF1R的异常表达已在胃癌、鼻咽癌及肾透明细胞癌等多种恶性肿瘤中有所报道。Yang等［13］研究结果展示CSF1R在肾透明细胞癌组织中的阳性表达率显著高于癌旁组织，其阳性表达与T分期、N分期及远处转移呈明显正相关，CSF1R是患者预后不良的独立预测因素。Okugawa等［14］通过免疫组化染色评估了148例胃癌组织中CSF-1R的表达水平，结果发现CSF-1R在胃癌样本中呈明显高表达，生存分析表明高表达者死亡与疾病复发进展风险分别是低表达者的1.38倍与1.79倍。后续细胞功能实验证实上调CSF-1R表明明显促进了胃癌细胞的增殖、迁移与抗凋亡能力［14］。然而，目前国内外尚无关于CSF-1R在结直肠癌中表达及其预后意义的相关报道。在本研究中，我们发现在结直肠癌样本中CSF-1R的阳性表达率为63.2%，显著高于癌旁组织；CSF-1R高表达者具有浆膜侵犯、淋巴结转移及淋巴血管浸润等特点，预示患者预后不佳。在今后的研究中，我们拟进一步开展细胞实验，以明确CSF-1R对结直肠癌细胞生物学功能的影响。

综上所述，本研究结果表明LGR5与CSF1R在结直肠癌中呈明显阳性表达，并与肿瘤恶性生物学行为密切相关，二者是结直肠癌患者预后不佳的独立预测因子。这些发现进一步强调了LGR5与CSF1R在结直肠癌发生发展过程中的致癌作用，为肿瘤临床治疗提供了新的思路。