徐唐芸，陈颖颖，鲁东昊，陆 翔，陈凌涛，陈培云

(浙江万里学院生物与环境学院，浙江 宁波 315000)

黄酮类化合物(flavonoids)在结构上是两个苯环通过三个碳原子相互连接而形成的具有C6-C3-C6基本碳架的化合物[1]。广泛存在于绝大多数果蔬和药用植物中。目前已被发现达到万种[2]，是具多种生物活性的一类植物次生代谢产品。研究结果，表明黄酮类化合物具有多种生理作用，如抗氧化、抗自由基、预防炎症、抑制细菌、抗肿瘤、降低血脂及胆固醇、提高机体免疫力、护肝作用和应用于受创伤的中枢神经系统治疗等[3-7]。因此，如何从植物中有效提取出黄酮类化合物是久经不衰的研究热点。

十字花科蔬菜是黄酮类化合物含量较高的蔬菜种类[8]。西兰花，别名花椰菜(BrassicaoleraceaL.var.botrytis L.)为十字花科芸薹属的一或二年生草本植物，是甘蓝的变种，因西兰花的适应性较强，目前在我国除西部地区之外都在大量种植西兰花，如临海的西兰花种植基地规模及产量很高且为其农业名片之一[9]。西兰花富含多种功能性成分如蛋白质、多糖、维生素和胡萝卜素，还有丰富的黄酮类化合物[10]。为扩大西兰花的产业价值链，黄酮类化合物的提取是西兰花产品深加工的出路之一。而大部分黄酮类化合物在西兰花的花蕾富集[11]。

目前大多数黄酮类化合物提取工艺中使用的溶剂通常都不可再生，且还存在易燃、易挥发，大多还有毒性，普遍有污染环境的问题[12]。低共熔溶剂(Deep eutectic solvents，DESs)是Abbott提出的由一定比例的氢键受体(HBA)和氢键给体(HBD)组合成的两或三组分低共熔混合物，具有无毒、可降解、轻易制备、成本低及具有离子液体的长处等优势[13-14]。因此，越来越多的注意力集中在DESs的应用上[15]。在应用DESs提取黄酮方面，Xia等[16]建立了一种利用由氯化胆碱、乳酸合成DESs，从玉竹的根茎中提取黄酮类活性成分的方法。Naseem等[17]应用由氯化胆碱和乙二醇组成的DES实现对柠檬香茅中包括黄酮类在内的活性成的萃取且优于常规溶剂。李婷婷[18]采用加热方法制备低共熔溶剂，以 1:2 的氯化胆碱/乳酸含水量为 20%的低共熔溶剂作为提取溶剂，实现了对黄芩中黄芩苷、汉黄芩苷、黄芩素与汉黄芩素的高效提取。DESs作为萃取剂，为绿色高效萃取提供了新方法和新思路。

本实验设计合成低共熔溶剂用于西兰花花蕾中总黄酮的提取研究，以西兰花花蕾总黄酮的提取率为指标，采用单因素和正交试验优化西兰花花蕾总黄酮的提取工艺，以期望提供一种高效环保的提取方法。

1 材料与方法

1.1 材 料

西兰花材料购自宁波本地超市。

1.2 主要试剂与仪器设备

1.2.1 试剂

无水乙醇、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、氯化胆碱、丙三醇、乙二醇、1，2-丙二醇、1，4-丁二醇，均为分析纯，国药集团化学试剂有限公司；芦丁标准品采购自上海源叶生物科技有限公司。

1.2.2 仪器

L18-Y91A高速破壁调理机，九阳股份有限公司；HH-2数显恒温水浴锅，金坛市盛蓝仪器制造有限公司；DHG-9053A电热恒温鼓风干燥箱，上海蚁霖科学仪器有限公司；QL861漩涡振荡器，海门市其林贝尔仪器制造有限公司；LC-180低速离心机，科大创新股份有限公司中佳分公司；UV-3000PC型紫外可见分光光度计，上海翱艺仪器有限公司。

1.3 方 法

1.3.1 制备DESs溶剂

DESs种类不同，对黄酮的提取效果不同[19-21]，以氯化胆碱(HBA)与不同的HBD按一定的摩尔比混合，采用加热法[22]，即在80 ℃下搅拌，直至呈现无色均匀的液体，然后冷却至室温，制备出不同的DESs，如表1所示。

表1 不同的EDS溶剂种类及其比例

1.3.2 西兰花花蕾总黄酮提取方法

取适量西兰花花蕾，进行剪切处理，放入干燥箱中进行干燥，干燥温度90 ℃，时间为2 h。冷却后用磨粉机粉碎成粉末，先后过40、60目筛，备用。准确称取西兰花花蕾粉末 0.5 g于装入50 mL离心管中，加入一定液料比的不同含水量的DESs，用漩涡震荡仪充分混匀后，在一定温度下，水浴加热一定时间，以5000 r/min离心15 min取得上清液，得到总黄酮提取液。

1.3.3 标准曲线制备

精密称取10 mg芦丁标品，用60%乙醇溶解，配制成 0.20 mg/mL的芦丁标准品溶液。准确吸取0.0、2.5、5.0、7.5、10.0 mL的标准品溶液于25 mL比色管中，加入1.0 mL 5%亚硝酸钠溶液、1.0 mL 10%硝酸铝溶液，震荡均匀后静置5 min，再加入10.0 mL 4%氢氧化钠溶液，用60%乙醇定容，震荡均匀后静置15 min。在510 nm波长下测吸光度，根据芦丁浓度和吸光度绘制标准曲线。

1.3.4 西兰花花蕾总黄酮含量测定

取样品总黄酮提取液适量至25 mL比色管中，后续操作按照测定标准曲线的方法进行，参照芦丁标准曲线计算总黄酮浓度。按下列公式计算其提取率，公式[23]如下：

W(总黄酮得率，mg/g)=

1.3.5 单因素测定

采用单因素试验考察HBA-HBD摩尔比、DES含水量、液料比、水浴温度、提取时间对西兰花花蕾总黄酮提取效果的影响。单因素实验设计如表2所示。

表2 单因素试验表

1.3.6 正交试验优选

在单因素试验的基础上优化实验结果，选取提取工艺条件液料比、温度和提取时间进行L9(33)，探讨该三个因素及其不同水平对西兰花花蕾中总黄酮得率的影响。正交试验因素水平如表3所示。

表3 正交试验因素水平

2 结果与分析

2.1 标准曲线绘制

由芦丁标准品浓度和吸光度的测定结果绘制标准曲线见图1，有显著的呈线性。线性回归方程为Y=13.715x-0.0026，R2=0.9999，其中Y为吸光度，X为芦丁标准品浓度。

图1 芦丁标准曲线

2.2 不同的EDS溶剂种类提取结果

不同氢键供体的类型是影响DESs密度、表面张力和粘度等物理化学性质的因素，也对目标成分的提取有重要的影响[24]。以氯化胆碱为HBA，并选择不一样的HBD，加热搅拌后制备DES。比较不同的HBD的DES对总黄酮得率的影响，制备四种不同的DES，结果如图2所示，总黄酮得率的大小为1，4-丁二醇>1，2-丙二醇>乙二醇>丙三醇。其中1，4-丁二醇总黄酮得率达到3.224 mg/g。因此，最终确定1，4-丁二醇为最佳提取溶剂，作为后续的实验条件。

图2 不同DESs对西兰花花蕾总黄酮得率的影响

2.3 单因素试验结果

2.3.1 不同HBA-HBD摩尔比的DES对总黄酮得率的影响

固定氯化胆碱(HBA)/1，4-丁二醇(HBD)为DES，30%含水量，液料比1:25，提取温度70 ℃，提取时间60 min，在DES摩尔比1:1、1:2、1:3、1:4的条件下，西兰花花蕾最终的总黄酮得率如图3示。随HBA-HBD摩尔比的增大，得率也在提高，在HBA-HBD摩尔比为1:3时达到最大值，在更高的摩尔比时，得率反而下降。可能是因为摩尔比为1:3的DES具有更低的黏度和表面张力，提高了传质率，使提取溶剂更易去渗透和促进溶出西兰花花蕾的总黄酮。因此，确定氯化胆碱(HBA)/1，4-丁二醇(HBD)摩尔比为1:3的DES为最佳比例的提取溶剂，作为后续的实验条件。

图3 HBA-HBD摩尔比的DES对总黄酮得率的影响

2.3.2 不同含水量的DES对总黄酮得率的影响

固定氯化胆碱(HBA)/1，4-丁二醇(HBD)摩尔比1:3的DES，液料比1:25，提取温度70 ℃，提取时间60 min，在含水量为10%、20%、30%、40%、50%的条件下，西兰花花蕾总黄酮提取率如图4所示。随着DES含水量的增多，总黄酮的得率不断上升，当DES含水量为30%时，总黄酮的率达到最高，超过30%后，总黄酮得率又开始下降。这可能是因为含水量影响DES的极性和粘度，水的加入使DES的粘度降低和极性增加，但是过量的水反而会抑制成分间的相互作用，因此确定DES最佳含水量为30%作为后续的实验条件。

图4 不同含水量的DES对总黄酮得率的影响

2.3.3 不同液料比对总黄酮得率的影响

固定氯化胆碱(HBA)/1，4-丁二醇(HBD)摩尔比1:3的DES，提取温度70 ℃，提取时间60 min，在液料比分别为1:10、1:15、1:20、1:25、1:30的条件下，西兰花花蕾的总黄酮得率如图5示。随液料比的增大，总黄酮的得率增大。但是液料比达到1:25以后不再增加，开始出现下降。这可能是因为液料比对总黄酮的传质率有重要影响，液料比的增加增大了西兰花花蕾颗粒与DES之间的接触面积和使样品成分浓度的下降，增大了黄酮类化合物向溶剂移动的扩散系数，因此会增加非目标物质的析出，影响提取效果，还会造成溶剂的浪费，提高成本。因此，确定1:25为最佳液料比，作为后续实验条件。

图5 液料比对总黄酮得率的影响

2.3.4 不同提取温度对总黄酮得率的影响

固定氯化胆碱(HBA)/1，4-丁二醇(HBD)，摩尔比1:3的DES，30%含水量，液料比1:25，提取时间60 min，在提取温度分别为40 ℃、50 ℃、60 ℃、70 ℃、80 ℃的条件下，西兰花花蕾总黄酮得率如图6所示。随着提取温度在一定范围内的不断升高，西兰花花蕾总黄酮的得率呈上升趋势。当提取温度到达70 ℃时，得率到达最高，随后得率随提取温度的升高反而降落。这可能是因为升高温度会导致DES的粘度、表面张力和极性降低，有利于总黄酮的溶出。升高温度会加快分子的活动，加快目标物质扩散。但过高的温度将会导致黄酮类发生如氧化分解等现象，从而降低得率。因此，确定提取温度为 70 ℃，作为后续最佳提取温度。

图6 提取温度对总黄酮得率的影响

2.3.5 不同提取时间对总黄酮得率的影响

固定氯化胆碱(HBA)/1，4-丁二醇(HBD)，摩尔比1:3的DES，30%含水量，液料比1:25，提取温度70 ℃，在提取时间分别为40、50、60、70、80 min的条件下，西兰花花蕾总黄酮提取率如图7所示。随提取时间的延长，西兰花花蕾总黄酮的得率升高，当提取时间达到70 min后，西兰花花蕾总黄酮得率达到最大，且不再增加反而出现降低。这可能是因为随着提取时间的增加，使DES充分渗透于西兰花花蕾颗粒中，促使目标物质溶出，使总黄酮得率提高。而进一步延长萃取时间可能会导致目标化合物的分解或者是发生其他的化学反应。因此，确定60 min的提取时间，作为最佳提取时间。

图7 提取时间对总黄酮得率的影响

2.4 正交试验结果

采用正交L9(33)设计试验，以其得率为指标，结果与分析见表3。由此可见，三因素对西兰花花蕾总黄酮提取影响强度依次为：C>A>B，即提取时间>液料比>温度。其中在提取时间中最佳水平为C3，液料比中最佳水平为A2，温度中最佳水平为B3。因此，最佳组合为A2B3C3。由于该组合未在试验中出现，因此需验证并重复三次。结果表明，在该最佳组合条件中得到西兰花花蕾总黄酮得率为(4.435±0.023)mg/g，高于组合A2B2C3的得率，说明试验可靠。

表4 正交实验结果与极差分析

3 结 论

因大部分黄酮类化合物在西兰花的花蕾富集，本文采用低共熔溶剂作为溶剂，以西兰花花蕾总黄酮得率为指标，采用单因素和正交试验优化西兰花花蕾总黄酮的提取工艺。选用摩尔比为1:3的氯化胆碱和1，4-丁二醇制备低共熔溶剂，取得当低共熔溶剂含水量为30%，料液比1:25，温度75 ℃提取 65 min时，总黄酮最后得率可达(4.435±0.023)mg/g的结果。该研究结果表明低共熔溶剂可作为提取西兰花花蕾总黄酮的有效提取溶剂。