李浩铃,陈思睿，李杰彤，戚思兰，陈宝龙，舒 琥

(1 广州大学生命科学学院，广东 广州 510006；2 华南师范大学附属中学，广东 广州 510635)

在高密度集约化的养殖场中，2017年总氮排放量为216万吨[1]，过量的饲料和排泄物导致氨氮等超标严重，污染养殖场周边水体环境，养殖废水的达标排放一直以来是养殖行业以及环保部门最为关注的话题。

生物脱氮，一般包括好氧硝化以及厌氧反硝化。异养硝化现象最早是由Papen H等在1894年从粪产碱杆菌Alcaligenesfaecalis中发现的[2]，研究者陆续在其他的方面也发现的异养硝化现象[3]；20世纪80年代，Robertson等首次分离鉴定出具有好氧反硝化作用的细菌——泛养硫球菌Thiospherapantotroph[4]，该菌株的发现很好地解决了厌氧和好氧严格分开的问题，传统生物脱氮技术具有处理成本低、二次污染小等优势[5-6]，但在某些极端环境中去除率并不高，且脱氮性能比较单一，无法满足现今可持续发展的要求[7-8]。

本研究从养殖池中筛选出具有异样硝化-好养反硝化作用的细菌，进行菌株脱氮性能的探究，为新型生物脱氮工艺提供一定的基础资料和技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1 样品来源

广东省广州市西朗珠江水产研究所养殖池塘底泥。

1.1.2 主要试剂

革兰氏染色试剂，盐酸，氨基磺，亚硝酸钠，氯化铵，硝酸钠，磷酸，对氨基苯磺酰胺，N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐，氯化铵，酒石酸钾钠，纳氏试剂等。

1.1.3 培养基

发酵培养基(g/L)：KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，Na2HPO47.9 g，(NH4Cl 0.6036 g/NaNO30.9590 g/NaNO20.779 g)，柠檬酸钠 5.66 g，微量元素溶液2 mL，H2O 1000 mL，pH 7.2；BTB培养基(g/L)：KH2PO41.5 g，MgSO4·7H2O 0.01 g，Na2HPO47.9 g，NaNO30.8415 g，NH4Cl 0.192 g，NaNO20.362 g，柠檬酸钠 5.66 g，微量元素溶液 2 mL，BTB溶液1 mL，琼脂25 g，H2O 1 000 mL，pH 7.0～7.5。

1.2 方 法

1.2.1 菌株分离纯化

称取泥样10 g用无菌水稀释制备成10-1～10-5稀释液，取0.1 mL在BTB培养基中进行涂布，倒置于28 ℃恒温培养箱中培养1～3 d，再挑单菌落分区划线3～4次，进行镜检以确定其纯化与否。

1.2.1 菌株的筛选

将已纯化的菌株利用点接法接种于BTB反硝化鉴定培养基中培养1～3 d，根据菌落与颜色圈之比筛选出反硝化性能较强的菌株。将菌株接种于营养肉汤中以28 ℃，180 r/min振荡培养1 d，以1%的接种量分别接种于三种模拟废水的培养基中，以28 ℃，180 r/min振荡，每隔24 h取2mL发酵液，取满48h，测OD600后，并以 4000 r/min，5 min 离心处理，分别测量三种氮源的含量，并将性能较好的菌株用营养琼脂斜面培养基保存。

1.2.2 脱氮性能测定

将复筛所得的性能较强的菌株BB18斜面，重复1.2.1步骤，每隔12 h取2 mL发酵液，取满48 h，测量OD600后离心处理，分别测量三种氮源的含量。

1.2.3 测定分析方法

菌群的生长情况采用酶标仪分析，氨氮采用纳氏试剂分光光度法(GB HJ535-2009)测定；亚硝态氮采用N-(1-萘基)-乙二胺二盐酸盐分光光度法(GB 7493-87)测定；硝态氮采用紫外分光光度法(GBHJ/T346-200)测定；除氮率计算公式如下：

式中：C0为0 h的浓度，Ci为i h的浓度。

1.2.4 菌株的鉴定

对菌株的菌落形态进行检测[9-10]和16SrRNA PCR扩增，采用一对通用引物[11]：上游引物(27F)：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′；下游引物(1492R)：5′-GGCTACCTTGTTACGACTT-3′，采用20 μL PCR反应体系：2×HieffTM PCR Master Mix(With Dye)1 μL，27F和1492R各 1 μL，DNA 模板 1 μL，ddH2O 17 μL。PCR程序如下：94 ℃，5 min；94 ℃ 预变性，1 min；55 ℃退火，1 min；72 ℃延伸 1.5 min；72 ℃，8 min；循 环 30 次。

通过琼脂糖凝胶电泳分析PCR 结果，将PCR 产物的纯化和测序送至上海生物工程有限公司，测序结果通过 ExBioCloud比对分析，并利用MEGA 7.0 软件构建系统发育树。

2 结果与分析

2.1 菌株的筛选、纯化

通过分离纯化，初步分离到82株具有脱氮性能的菌株，通过BTB反硝化鉴定培养基初筛得36株菌株，最后利用48 h内脱氮性能降解情况复筛得到5株能降解三种氮源的菌株。

2.2 BB18菌株脱氮性能的测定

在2.1菌株复筛的结果中，选择一株脱氮性能最强且比较明显的菌株BB18，在模拟养殖废水的发酵液中进行脱氮性能测定。

2.2.1 BB18在模拟废水中氨氮降解情况

图1 BB18菌株在氨氮模拟废水中的生长及氨氮降解情况

2.2.2 BB18在模拟废水中亚硝态氮降解情况

图2 BB18菌株在亚硝态氮模拟废水中的生长及亚硝态氮降解情况

2.2.3 BB18在模拟废水中硝态氮降解情况

在硝态氮模拟废水中，测定菌株的生长量OD600和硝态氮含量OD275和OD220，结果如图3 所示，菌株在经历约6 h迟缓期后，逐渐上升进入对数期，在24 h 达到最大值；硝态氮降解率随着对数期而升高，0～24 h降解率上升，24 h后略微地上升，在48 h 达到80.60%。前期由于菌体需要适应高浓度的硝酸盐环境，因此一开始菌株生长比较慢，从而硝酸盐利用率低。由图3可知，菌株对硝酸盐的利用是相对比较高的。

图3 BB18菌株在硝态氮模拟废水中的生长及硝态氮降解情况

2.3 BB18菌株的形态学

如图4、图5所示，菌株BB18菌落大小中等、米白色、圆形，边缘不整齐，不透明，质地光滑，有粘性，表面略突起；显微镜下细胞直杆状，单个排列，无芽孢革兰氏阴性。

图4 BB18菌株平板菌落形态特征

图5 BB18菌株革兰氏染色镜检

2.4 BB18菌株16S rRNA 的序列测定及系统进化树

如图6、图7所示，BB18通过ExBioCloud比对后，具有高相似度的Pseudomonasguguanensis、P.medocina等通过MEGA 7.0 软件构建系统发育树，在发育树中，通过分支长度和自展值可得，菌株BB18为假单胞菌属，与P.alcaligenes、P.fluvialis、P.guguanensis和P.pharmacofabricae进化方向相同，与P.guguanensis的亲缘关系最为接近，且bootstrap值为100，可靠度最强。

图6 菌株BB18 16S rRNA PCR 产物琼脂糖凝胶电泳图谱

图7 BB18的系统发育树

3 讨 论

近年来，水产养殖业中养殖饲料残饵和排泄物等物质的分解，导致水体中氨态氮等含量过高[12]，造成的经济损失无法估量，目前大多数处理污水采用的是传统脱氮技术与生物脱氮结合，但其消耗的成本比较高。

在进行脱氮性能的测定中，菌株BB18具有高效脱氮性能，氨氮、亚硝态氮、硝态氮去除率分别为92.76%、80.60%、90.95%，所得结果与成钰等人在以葡萄糖作为碳源的反硝化培养基中分离的花津滩芽孢杆菌的情况相似[13]，其菌株24 h内对氨氮、亚硝酸氮和硝酸氮的去除率分别达到100%、99.5%和85.6%，相比刘小英等从污水池的活性淤泥筛选的氨氮降解周期为5d的菌株[14]，说明BB18具有高效脱氮性能和脱氮周期短的特点。

4 结 论

BB18菌落中等大小，为米白色，呈现圆形，边缘不整齐，不透明，质地光滑，有粘性，表面略突起，细胞形态呈现直杆状，单个排列，初步鉴定为假单胞菌属，在28 ℃培养48 h，在12～18 h内到达生长对数期，其氨氮去除率在18 h可达92.76%，硝态氮去除率在48 h可达80.60%，亚硝态氮去除率在24 h可高达90.95%。