赵杰,周天红,刘选辉,冯士彬,辜丽川,李玉,吴金节,王希春*

(1.安徽农业大学动物科技学院,安徽 合肥 230036;2.宠颐生天红宠物医院,安徽 合肥 230011;3.安徽农业大学信息与计算机学院,安徽 合肥 230036)

赭曲霉毒素是由多种真菌产生的有毒代谢产物,包括赭曲霉毒素A(OTA)、赭曲霉毒素B(OTB)、赭曲霉毒素C(OTC)等[1]。其中,OTA对谷物和中药材污染最严重,具有免疫毒性、肝肾毒性、致畸性、致突变性和致癌性[2-3]。OTA是一种临床上常见的霉菌毒素,在谷物收获、储存及酿造过程中的污染都会发生[4]。其中肾毒性最为突出,影响动物和人类的健康。大量研究认为氧化应激可能是OTA诱导细胞毒性和凋亡的重要机制之一。

番茄红素(lycopene,LYC)是类胡萝卜素的一种,其结构中的共轨双键能够和细胞内产生的氧自由基发生氧化还原反应,内源性反应消耗活性氧(ROS)、活性氮(RNS)等有害物质,从而发挥抗氧化作用,故具有一定的预防心血管疾病、促进机体免疫和防癌抗癌等作用[5]。在类胡萝卜素中,LYC的抗氧化性远远强于其他多种类胡萝卜素(花青素、虾青素、叶黄素、胡萝卜素等),甚至强于维生素E。除此之外,LYC还具有抗炎、抗氧化、抗癌、免疫调节、改善血脂、预防癌症等生物学活性[6]。研究发现LYC可有效缓解OTA引起的肾脏组织的DNA损伤,抵抗OTA导致的大鼠肾脏的氧化应激和细胞凋亡[7-8]。国内外对OTA的毒性机制及LYC的保护机制进行了大量研究,但对其毒性与MDCK毒性效应的研究和番茄红素作为保护剂的研究则较少报道。本研究以MDCK为模型,研究OTA对细胞结构、细胞凋亡、肾功能相关指标、氧化与抗氧化等指标的影响,探讨LYC在OTA致MDCK损伤中的保护效应,为治疗OTA引起的肾损伤提供理论基础,也为寻找缓解犬肾脏OTA毒性的药物提供新的研究方向。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 试验细胞株犬肾小管上皮细胞(MDCK,Procell CL-0154),购于武汉普诺赛生命科技有限公司。

1.1.2 试剂材料OTA标准品(粉末,纯度≥ 99%),美国Sigma公司;LYC标准品,Solarbio生物技术有限公司;CCK-8试剂和SOD、GSH-Px、CAT、MDA及DCFH-DA试剂盒,南京森贝伽生物科技有限公司;Annexin V-FITC/PI试剂盒,万类(沈阳)生物科技有限公司;肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素6(IL-6)、白细胞介素18(IL-18)及白细胞介素1β(IL-1β)和N-乙酰-β-D-葡萄糖苷酶(NAG)、血清β2微球蛋白(β2-MG)、肾损伤分子 1(KIM-1)、视黄醇结合蛋白(RBP)检测试剂盒,江苏正能生物科技公司;LDH检测试剂盒,南京森贝伽生物科技有限公司。TGL-18R型冷冻高速离心机,珠海黑马医学仪器有限公司;TEOL-2010透射电子显微镜,日本电子株式会社;XDS-1B倒置生物显微镜,日本Nikon公司;CX31型生物显微镜,日本Olympus公司;全自动生化分析仪,深圳迈瑞公司;FACSCalibar流式细胞分析仪,美国BD公司;Multiskan Mk3酶标仪和Smart2Pure 12 UV/UF超纯水一体仪,美国Thermo Fisher公司。

1.2 细胞培养及传代

从液氮罐中取出MDCK,置于37 ℃的恒温水浴锅,加入细胞冻存液与细胞培养液按1∶8配制好的培养液,混合均匀,离心,取沉淀,再加入1 mL新鲜培养液,混匀,转移至4 cm×6 cm培养瓶中,再添加 4 mL 培养液,置于37 ℃、5% CO2恒温细胞培养箱中培养。待细胞生长密度达到80%～85%,弃上清液,胰酶消化细胞,当消化至80%～90%,加培养液终止消化,离心,取沉淀,加培养液吹打混合均匀置于细胞培养箱。

1.3 OTA最适浓度和最佳处理时间及LYC最适浓度筛选

将对数生长期细胞消化吸收,计数板计数后,按照毎孔约8.5×103个细胞接种于96孔细胞培养板,经过24 h培养细胞贴壁后,分别用浓度为10、15、20 μmol·L-1OTA处理MDCK 24、36和48 h,同时设置空白对照组(CON),探索达到半数抑制数的OTA浓度和作用时间。重复操作,更换为终浓度为30、40、50、60 μmol·L-1的LYC混合培养液,探索LYC的细胞毒性以及最适浓度区间。使用15 μmol·L-1OTA攻毒贴壁细胞前分别添加50、55和60 μmol·L-1LYC预处理12 h,寻找最适保护作用浓度。每组3个重复,取平均值,计算各组细胞存活率。计算公式如下:

细胞存活率=(As-Ab)/(Ac-Ab)×100%。

式中:As为试验孔吸光值(含有细胞、培养基、CCK-8试剂);Ab为空白孔吸光值(含有培养基和CCK-8试剂);Ac为对照孔吸光值(含有细胞、培养基和CCK-8试剂)。

1.4 细胞生长及形态结构变化

将对数生长期细胞消化吸收,设置密度为8.5×103mL-1并重新铺板于6孔细胞培养板上生长,贴壁后更换培养基,使用15 μmol·L-1OTA染毒MDCK,同时设置保护剂LYC组(55 μmol·L-1LYC)及O+L组(15 μmol·L-1OTA+55 μmol·L-1LYC)处理MDCK,继续培养36 h,PBS冲洗2次。将各组细胞置于光学显微镜下拍照观察。重复上述操作,PBS冲洗,沥干后,加胰酶初步消化,收集所有细胞(包括上清液),离心弃上清液,缓慢加入2 mL 25 g·L-1戊二醛,浸没细胞团块,避光静置过夜。固定后置于PBS中 3 h,再转移至1%锇酸固定2 h。将样本置于系列梯度乙醇脱水,环氧树脂包埋,加热,切片,染色,使用透射电子显微镜观察细胞个体形态、细胞器结构。

1.5 MDCK的NAG、β2-MG、L-FABP、KIM-1、RBP、NGAL及LDH的检测

将处于对数生长期的MDCK接种于6孔细胞培养板。待细胞全部生长贴壁后弃去培养液,更换含有OTA的培养液染毒,并且设置LYC组,培养36 h,收集细胞,使用全自动生化分析仪检测各组NAG、β2-MG、L-FABP、KIM-1、RBP、NGAL水平。

LDH释放水平的测定使用LDH测定试剂盒。选择筛选后OTA浓度染毒处理对数生长期MDCK,继续染毒培养36 h。同时设置LYC组及O+L组,收集细胞上清液,按试剂盒说明上样,使用酶标仪检测各组D值,按公式换算得出LDH释放水平。

1.6 MDCK凋亡率的检测

将对数生长期细胞消化,按密度8.5×103mL-1接种于6孔细胞培养板,加15 μmol·L-1OTA攻毒处理(继续培养)36 h。同时设置LYC组及O+L组。收集处理各组细胞,按Annexin V-FITC/PI试剂盒说明书操作后,使用流式细胞仪检测。确保在1 h内全部检测完毕。

1.7 氧化与抗氧化指标检测

1.7.1 ROS水平检测将处于对数生长期的MDCK接种于6孔板,正常培养贴壁后,使用OTA进行攻毒操作。并且设置LYC组及O+L组,继续置于CO2恒温培养箱中培养36 h。加入二氯二氢荧光素-乙酰乙酸酯(DCFH-DA)探针37 ℃避光孵育30 min后离心,收集各组细胞并转移至流式检测管。上机检测前吹打均匀保证密度一致,检测时间不超过1 h。

1.7.2 氧化与抗氧化功能检测待MDCK生长至对数期,使用OTA攻毒,转移至CO2恒温培养箱中继续培养36 h,设置LYC组及O+L组。胰酶消化并收集细胞,按照试剂盒的操作说明,用酶标仪对氧化指标(MDA)与抗氧化指标(SOD、GSH-Px、CAT)进行测定,测出各孔D450值,计算MDA含量和SOD、GSH-Px、CAT活性。

1.8 细胞炎性因子水平检测

胰酶消化收集处理后的各组细胞样品,按照TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18试剂盒操作说明步骤处理,通过酶标仪测出各孔D450值,计算各组细胞炎性因子水平。

1.9 数据处理与分析

2 结果与分析

2.1 OTA及LYC的最适浓度及作用时间

如图1所示:当细胞生长暴露于10 μmol·L-1OTA中,细胞存活率显著降低(P<0.05),随着OTA浓度增加,高浓度组之间的细胞存活率差异较小,选定初期OTA攻毒浓度为15和20 μmol·L-1。如图2所示:使用不同浓度OTA处理24 h及48 h后的MDCK存活率均达不到试验要求;而经过15 μmol·L-1毒素处理36 h的MDCK存活率达到半数抑制数(P<0.01)。因此,后续的各项试验中OTA浓度均选择 15 μmol·L-1作用36 h作为试验条件。如图3所示:选择30、40、50、60 μmol·L-1的LYC处理MDCK,在浓度为50 μmol·L-1时,其促进效果十分明显,且细胞存活率最高(P<0.01),再分别设置50、55、60 μmol·L-1LYC预处理 12 h,然后用15 μmol·L-1OTA攻毒,试验组细胞与OTA组对比均有显著差异(P<0.05),其中 55 μmol·L-1LYC其细胞存活率最高,说明对MDCK的保护作用表现最好(P<0.01)。综合OTA及LYC浓度的筛选,后续试验均选用15 μmol·L-1OTA和55 μmol·L-1LYC。

图1 不同浓度赭曲霉素A(OTA)对犬肾小管上皮细胞(MDCK) 存活率的影响Fig.1 The effect of different concentrations of ochratoxin A(OTA) on Madin-Daby canine kidney cell(MDCK)viability *和**表示与对照组(CON)相比,差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。下同。* and ** indicated significant differences at 0.05 and 0.01 levels compared with control group(CON). The same below.

图2 OTA浓度及作用时间对MDCK 存活率的影响Fig.2 The effect of concentration and treatment time of OTA on MDCK viability

图3 不同浓度番茄红素(LYC)对MDCK存活率的影响Fig.3 The effect of different concentrations of lycopene(LYC)on MDCK viability A. 不同浓度LYC对MDCK存活率的影响;B. 15 μmol·L-1 OTA和不同浓度LYC对MDCK细胞存活率的影响。#和##表示与OTA组相比,差异显著(P<0.05)和极显著(P<0.01)。下同。A. Effects of different concentrations of LYC on MDCK viability;B. Effects of 15 μmol·L-1 OTA and different concentrations of LYC on MDCK viability. # and ## indicated significant differences at 0.05 and 0.01 levels compared with OTA group. The same below.

2.2 MDCK生长及形态结构变化

如图4所示:CON组贴壁情况正常,形态呈现扁平状,细胞之间衔接紧密;LYC组相较CON组,细胞形态更加完全;OTA组细胞贴壁数量急剧减少,仅有少数部分衔接,排列稀疏,多数细胞染毒后出现明显的皱缩,自身缩小呈圆形;O+L组细胞于镜下观察可见部分细胞衔接紧密,相较于OTA组不会缩小至皱缩。如图5所示:CON组与LYC组细胞形态未见明显异常,细胞体态饱满,细胞中线粒体及粗面内质网结构整体保存完整,核膜清晰,核染色质均匀;OTA组细胞膜多处破损,细胞质漏出,线粒体肿胀明显,结构模糊,内质网与线粒体嵴断裂,核染色质严重浓缩;与OTA组相比,O+L组细胞损伤明显减轻,形态改善,细胞核有轻微皱缩,线粒体嵴多处可见。

图4 OTA与LYC对MDCK形态的影响Fig.4 Effect of OTA and LYC on MDCK morphologyCON:空白对照Blank control;LYC:55 μmol·L-1 LYC;OTA:5 μmol·L-1 OTA;O+L:5 μmol·L-1 OTA+55 μmol·L-1 LYC. The same below.

图5 OTA与LYC对MDCK超微结构的影响Fig.5 The effect of OTA and LYC on the ultrastructure of MDCK 第2行为第1行方框区域放大。红色剪头代表染色质聚集;蓝色剪头代表细胞空泡化;黄色箭头代表内质网线粒体肿胀断裂。The second row magnifies the box of first row. The red arrow represents chromatin aggregation;blue arrow represents vacuolization of cells;yellow arrow represents the swelling and rupture of endoplasmic reticulum mitochondria.

2.3 OTA对MDCK中NAG、β2-MG、L-FABP、KIM-1、RBP、NGAL水平的影响

如图6所示:在4个组培养36 h后,使用生化分析仪和酶标仪检测MDCK各项指标。与CON组相比,OTA组MDCK的NAG、THP、β2-MG、L-FABP、KIM-1、RBP、NGAL水平升高幅度均最大,且差异极显著(P<0.01);LYC组的各项指标变化不显著;O+L组的各项指标也均有不同程度的升高,幅度相较于OTA组有一定程度的下降,且差异极显著(P<0.01)。与OTA组相比较,CON组的NAG、β2-MG、L-FABP、KIM-1、RBP、NGAL水平均极显著降低(P<0.01);LYC组的各项指标均极显著降低(P<0.01);O+L组各项指标含量均极显著降低(P<0.01)。

图6 OTA与LYC对MDCK的NAG、THP、β2-MG、L-FABP、KIM-1、RBP、NGAL水平的影响Fig.6 Effect of OTA and LYC on the levels of NAG,THP,β2-MG,L-FABP,KIM-1,RBP and NGAL of MDCK

2.4 OTA和LYC对MDCK中LDH释放水平的影响

如图7所示:和CON组比较,LYC组的LDH释放水平增加不明显,OTA组的LDH释放水平极显著提高(P<0.01);O+L组的LDH释放水平较OTA组释放水平有明显降低。

图7 OTA与 LYC对MDCK中LDH释放水平的影响Fig.7 The effect of OTA and LYC on LDH release levels of MDCK

2.5 OTA和LYC对MDCK凋亡率的影响

如图8所示:与CON组相比,OTA组MDCK凋亡率极显著升高(P<0.01),LYC组凋亡率变化不显著;与OTA组相比较,O+L组凋亡率极显著降低(P<0.01)。

图8 OTA与LYC对MDCK凋亡率的影响Fig.8 The effect of OTA and LYC on apoptosis rate of MDCKA. OTA与LYC对MDCK凋亡率影响散点图;B. OTA与LYC对MDCK凋亡率影响柱状图。A. Scatter diagram of the effects of OTA and LYC on MDCK apoptosis rate;B. Histogram of effects of OTA and LYC on apoptosis rate of MDCK.

2.6 OTA和LYC对MDCK氧化及抗氧化指标的影响

2.6.1 ROS水平如图9所示:与对照组相比,OTA组ROS水平极显著升高(P<0.01),LYC组ROS水平变化不明显;与OTA组相比,O+L组ROS水平极显著降低(P<0.01)。

图9 OTA与LYC对MDCK活性氧(ROS)水平的影响(DCFH-DA染色)Fig.9 The effect of OTA and LYC on the ROS level of MDCK(DCFH-DA staining)

2.6.2 OTA和LYC对MDCK中SOD、MDA、CAT、GSH-Px等指标的影响如图10所示:与CON组相比,OTA组SOD、CAT、GSH-Px活性均极显著下降(P<0.01),MDA含量极显著升高(P<0.01),LYC组各项指标差异不明显(P>0.05);与OTA组相比较,O+L组SOD、CAT、GSH-Px活性均极显著升高(P<0.01),MDA含量极显著降低(P<0.01)。

图10 OTA与 LYC对SOD、CAT、GSH-Px活性与MDA含量的影响Fig.10 The effect of OTA and LYC on activities of SOD,CAT,GSH-Px and MDA content

2.7 OTA和LYC对MDCK炎性细胞因子的影响

如图11所示:与CON组相比,OTA组TNF-α、IL-6、IL-18及IL-1β水平均极显著上升(P<0.01),LYC组除了IL-18水平变化并不显著,IL-6、IL-18及TNF-α水平极显著升高(P<0.01);与OTA组比较,O+L组的TNF-α、IL-6、IL-18及IL-1β炎性因子水平均极显著降低(P<0.01)。

图11 OTA与LYC对MDCK炎性细胞因子水平的影响Fig.11 The effects of OTA and LYC on inflammatory cytokines level of MDCK

3 讨论

不同的霉菌毒素会攻击不同的靶器官,从而表现出复杂的、全身性严重中毒[9]。OTA是一种临床上常见的霉菌毒素,其肾毒性最为突出,影响人与动物的健康,氧化应激是OTA诱导细胞毒性和凋亡的重要机制之一。OTA能够引起细胞凋亡,并可导致细胞死亡,如DNA片段化和细胞核的缩合[10]。LYC具有十分优异的抗氧化作用。本试验结果表明,15 μmol·L-1OTA处理后MDCK存活率极显著降低,细胞出现皱缩,破坏细胞超微结构及细胞器,导致细胞器肿胀变性,改变细胞形态,细胞凋亡率极显著增加。LYC单独作用于MDCK不会诱导细胞的凋亡,当其浓度达到55 μmol·L-1时,对细胞保护作用最好,进而缓解细胞凋亡。目前LYC的应用已十分广泛,其具有抗氧化、抗炎、抗癌、免疫调节、改善血脂、预防癌症等生物学活性[11-12]。

OTA对于动物肾脏的毒性研究已有诸多报道,LYC具有很强的抗氧化活性,LYC通过降低氧化应激、凋亡、炎症及DNA损伤等方式,缓解多种物质引起的肾损伤[13]。临床上多种指标可作为判断肾脏损伤的依据,如NAG、L-FABP、KIM-1、RBP这些指标水平增加时可以反映出肾脏功能出现异常,β2-MG的唯一代谢部位是肾脏,相比于血清肌酐,β2-MG的升高更早更显著[14-17]。已有研究以MDCK为模型,当出现肾功能损伤时伴随着NAG、KIM-1、NGAL水平的升高[18-19],本试验结果与之一致,可见OTA能够损伤MDCK,干扰细胞中多种物质的分泌,导致MDCK肾脏功能性指标改变。LYC作为保护剂能够显著降低肾功能指标表达水平,减少OTA对MDCK的毒性损伤,此结论与前人的研究结果一致[20]。本试验是使用细胞进行的体外试验,与在动物机体中存在一定差距,但试验选择检测的NAG、β2-MG、L-FABP、KIM-1、RBP、NGAL等反馈肾脏损伤效果的几项指标较为显著,可为临床试验提供重要参考。

机体内正常的氧化代谢过程会不断产生活性氧(ROS),但当细胞内的ROS产生过多,超过机体的清除能力,在细胞内大量聚集,会引起细胞氧化应激,对细胞造成氧化损伤[21]。抗氧化酶如SOD、CAT和GSH-Px等组成一个初级系统来清除自由基或形成与谷胱甘肽(GSH)有关的机制,若ROS得不到及时的清除,导致堆积并使脂肪酸发生脂质过氧化反应而产生MDA。Arbillaga等[22]在肾近曲小管上皮细胞上的研究发现OTA诱导细胞内ROS水平升高;Porrini等[23]发现血浆中LYC浓度的上升可以显著增加淋巴细胞氧化应激的耐受性;Bose等[24]发现冠心病患者持续60 d摄入番茄制品,显著降低体内MDA含量;同时研究表明LYC能通过诱导内源性抗氧化酶的活性,即CAT、SOD、GSH-Px等间接发挥抗氧化功能[25]。与上述观点大致类似,本研究发现OTA能够导致MDCK产生相比于对照组多出1倍的ROS,并且降低了SOD、CAT和GSH-Px活性,使MDA含量显著上升[26]。这与前人的研究相似,在添加LYC的情况下,细胞ROS产生量由22.1%下降至14.1%,保护效果十分显著,同时SOD、CAT和GSH-Px活性有所提高,MDA含量也显著下降,能够显著或极显著缓解OTA对细胞造成的脂质过氧化及氧化损伤。炎性细胞因子是免疫原等多种刺激剂诱导各种细胞产生的一种低分子量可溶性蛋白质,能够有效调节适应性免疫和固有免疫以及血液细胞、APSC多能细胞生成,同时还具有损伤组织修复等多种功能[27]。本试验结果显示,OTA染毒导致MDCK的TNF-α、IL-6、IL-1β、IL-18水平均显著上升,与前人研究结果一致,可见OTA对细胞的损伤也包括炎性损伤,而LYC能够有效修复来自OTA的炎性损伤,降低炎性细胞因子的表达。

细胞凋亡是细胞死亡的一种类型,是细胞启动了特定的高度进化保守的分子程序而引起自身的死亡[28]。已有研究表明OTA确实能够引起细胞凋亡,如DNA片段化和细胞核的缩合[29]。在细胞发生凋亡时,细胞通常会出现线粒体等细胞器破裂等现象特征,本试验中电镜观察结果与之基本相同,OTA染毒能够造成MDCK发生皱缩,胞膜受损破裂,细胞核质缩小,线粒体及内质网断裂等。从本试验结果可知,15 μmol·L-1OTA能够对MDCK造成41.7%的凋亡率,对细胞的抑制程度明显;在55 μmol·L-1LYC保护下,有13.7%的细胞受到保护未发生凋亡,可见LYC的保护效果明显,这与前人研究得出的LYC能够缓解诸多外源性物质导致的肾脏细胞凋亡的结论一致[30]。

综上,OTA染毒可降低MDCK存活率,改变细胞形态,破坏细胞超微结构及细胞器,增加LDH释放水平;导致细胞氧化与抗氧化失衡,诱导细胞发生凋亡;MDCK肾功能减弱或丧失,提高了细胞炎性因子TNF-α、IL-6、IL-18及IL-1β的表达量,增加MDCK炎性因子的释放。添加适量LYC能够显著缓解OTA对MDCK的细胞毒性损伤,维系肾功能相关指标的正常水平,修正氧化与抗氧化之间的失衡,抑制细胞凋亡的发生,并降低炎性细胞因子的表达。